王善輝

（江蘇省徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221006）

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（Duck tem?busu virus，DTMUV）引起的鴨出血性卵巢炎［1，2］。自2010年4月在我國發(fā)生以來，迅速傳播到河北、山東、江蘇、安徽、浙江、福建等省份，給我國鴨養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。臨床主要表現(xiàn)為雛鴨神經(jīng)癥狀甚至死亡，產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋率急劇下降等，產(chǎn)蛋率可從90%迅速下降至10%，甚至停產(chǎn)［3］。發(fā)病率為60%~100%，死亡率為5%~30%［4］。剖檢可見卵巢變性、萎縮，主要病變特征是雛鴨肝臟有白色針尖狀壞死灶等［5］。DTMUV屬于黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群成員，病毒基因組為長約10 990 nt的單股正鏈RNA，編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白［6］。其中，E蛋白具有良好的免疫原性，是鴨坦布蘇病毒的主要保護(hù)性抗原。其表面存在大量的抗原表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體［7］。

疫苗免疫是預(yù)防該病流行、傳播的有效手段。新型鴨坦布蘇亞單位疫苗研制項目組前期預(yù)測并合成DTMUV的E基因的融合表位蛋白（TBE），采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了該融合表位蛋白，研制出一種新型鴨坦布蘇病毒病重組亞單位疫苗［8］。為探明該重組亞單位疫苗的安全性和保護(hù)性，本試驗(yàn)將3批次實(shí)驗(yàn)室疫苗制品分別以高、中、低劑量組免疫7日齡雛鴨；并以高劑量免疫200日齡產(chǎn)蛋鴨。通過對免疫鴨食欲、精神狀態(tài)、注射部位觀察及體重增加情況的監(jiān)測及對產(chǎn)蛋鴨的產(chǎn)蛋量與孵化率進(jìn)行統(tǒng)計以評價疫苗的安全性，攻毒保護(hù)試驗(yàn)評價疫苗的保護(hù)性，旨在為疫苗進(jìn)一步擴(kuò)大臨床試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 疫苗、毒株及動物

按照王善輝等［9］提供的方法在實(shí)驗(yàn)室制備3批次的DTMUV病重組亞單位疫苗，批號分別為20201020、20201110、20201120。DTMUV病商品活疫苗（WF100株）購自齊魯動物保健品有限公司；DTMUV JSXZ株由徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保存；SPF雞胚購自濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司；櫻桃谷雛鴨、產(chǎn)蛋鴨購自徐州市睢寧縣某養(yǎng)鴨場，經(jīng)檢測不含抗DTMUV的母源抗體。

1.2 分組及免疫

1.2.1 雛鴨免疫將550只7日齡櫻桃谷雛鴨隨機(jī)分成11組，50只/組，其中1~9組分別為高、中、低劑量的重組亞單位疫苗免疫組，第10組為商品活疫苗（WF100株）免疫組，第11組為非免疫對照組，注射磷酸鹽緩沖液1.5 mL/只。重組亞單位疫苗免疫組經(jīng)頸部肌肉注射疫苗，1、4、7組免疫0.5 mL/只，2、5、8組免疫1.0 mL/只，3、6、9組免疫1.5 mL/只。商品疫苗組肌肉注射（0.5 mL/只）。首免2周后加強(qiáng)免疫。相同條件下，將各組鴨分開隔離飼養(yǎng)。

表1 分組及免疫劑量

1.2.2 產(chǎn)蛋鴨免疫200日齡櫻桃谷產(chǎn)蛋鴨250只，隨機(jī)均分成5組，50只/組，其中1~3組為重組亞單位疫苗免疫組，分別注射3批疫苗，1.5 mL/只；第4組為商品活疫苗免疫組，第5組為非免疫對照組，各組鴨分開隔離飼養(yǎng)。

1.3 安全性檢測

1.3.1 雛鴨全身及注射部位反應(yīng)免疫后觀察1~3周雛鴨的精神狀態(tài)與采食情況。各免疫組及對照組隨機(jī)取5只免疫鴨，剖檢觀察疫苗吸收情況，即疫苗注射部位是否有疫苗顆粒，是否出現(xiàn)紅腫、出血及炎性滲出等病變。免疫后28 d每組分別隨機(jī)抽取20只免疫鴨及非免鴨稱重，比較其對增重的影響。

1.3.2 產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋量與孵化率記錄產(chǎn)蛋鴨免疫后30 d內(nèi)的產(chǎn)蛋數(shù)量，并進(jìn)行標(biāo)記。比較免疫鴨與非免疫種鴨同期產(chǎn)蛋數(shù)。從產(chǎn)蛋鴨免疫后4~6 d內(nèi)每組隨機(jī)抽取80枚入孵蛋，統(tǒng)計孵化率。

1.4 雛鴨免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)

首免后28 d，于免疫組隨機(jī)抽取10只鴨，肌肉注射200 U/只（1ELD50病毒量為1 U）的DTMUV JSXZ株。分離血清用于病毒分離。經(jīng)卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚，每胚0.1 mL。24~72 h死亡的雞胚按照王永娟等［10］建立的方法，通過RT-PCR法檢測E基因，陽性胚判為DTMUV感染死亡雞胚。只要有1枚雞胚感染，即判定這只鴨病毒分離陽性，為發(fā)病鴨。記錄發(fā)病鴨數(shù)量，并計算各組疫苗的保護(hù)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 雛鴨食欲、精神狀況及注射部位觀察

首次免疫后連續(xù)觀察21 d，免疫雛鴨與非免疫鴨采食、精神狀況均正常，未見任何全身不良反應(yīng)。檢查免疫鴨注射部位（每組隨機(jī)取出5只鴨），所有免疫鴨均未見局部出血、滲出、水腫及肉芽腫塊或腫脹等病變。剖檢可見高劑量組個別免疫鴨在注射部位有少量微小疫苗顆粒存在，其余鴨對疫苗全部吸收良好。

2.2 雛鴨體重增長情況

由表2可見，首免后28 d時，3批次疫苗的高、中、低劑量組免疫鴨和非免疫鴨的體重?zé)o明顯差異，重組亞單位疫苗免疫沒有影響雛鴨體重。

表2 首免后28 d各組鴨平均體重

2.3 產(chǎn)蛋鴨的產(chǎn)蛋量與孵化率

產(chǎn)蛋鴨免疫后，每天統(tǒng)計各組鴨產(chǎn)蛋數(shù)量，連續(xù)統(tǒng)計30 d。結(jié)果（表3）顯示，產(chǎn)蛋量在免疫后第4天開始下降，下降2~3個百分點(diǎn)，然后逐漸恢復(fù)，到第10天已經(jīng)基本恢復(fù)到同組鴨免疫前的產(chǎn)蛋率。且在種鴨免疫后4~6 d內(nèi)每組隨機(jī)抽取80枚入孵蛋，統(tǒng)計孵化率，經(jīng)比較免疫組與對照組無明顯差異。說明疫苗對免疫后30 d內(nèi)產(chǎn)蛋鴨的產(chǎn)蛋率和免疫后4~6 d入孵蛋的孵化率無明顯影響。

表3 免疫種鴨的產(chǎn)蛋及孵化情況

2.4 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

雛鴨在首免后28 d攻毒，觀察15 d。非免疫組10只鴨均出現(xiàn)明顯的食欲不振、排綠色糞便、后期則出現(xiàn)癱瘓等癥狀，其中4只死亡。剖檢顯示病鴨肝臟、脾臟、腺胃、腦膜有出血、壞死等病變；商品活疫苗免疫組10只鴨未出現(xiàn)臨床癥狀，保護(hù)率為100%。1、4、7組分別有3只鴨出現(xiàn)食欲不振、排綠色糞便等輕微癥狀，15 d后癥狀基本消失，其保護(hù)率均為70%；低劑量免疫組和非免疫組所有發(fā)病鴨體內(nèi)都分離到DTMUV。中、高劑量重組疫苗免疫組鴨未出現(xiàn)臨床癥狀，剖檢未見異常，均未分離到DTMUV，保護(hù)率均為100%。結(jié)果表明，3個批次的重組亞單位疫苗都能夠很好地保護(hù)免疫雛鴨免受DTMUV的攻擊，達(dá)到與商品活疫苗相同的保護(hù)效果（表4）。

表4 雛鴨免疫后DTMUV攻毒試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

為檢測新型鴨坦布蘇亞單位疫苗研制項目組前期研制的鴨坦布蘇病毒病重組亞單位疫苗的安全性，試驗(yàn)將3個批次的實(shí)驗(yàn)室疫苗制品按高、中、低3個劑量組分別免疫9組7日齡雛鴨，設(shè)商品活疫苗對照組及非免疫對照組。通過觀察免疫鴨食欲、精神狀態(tài)、注射部位病變及體重增加情況來評價疫苗的安全性。

安全性試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫鴨食欲、精神狀態(tài)均正常，注射部位未見明顯病變，體重增長情況與非免疫組鴨一致。產(chǎn)蛋鴨免疫后，每天統(tǒng)計各組鴨產(chǎn)蛋數(shù)量，連續(xù)統(tǒng)計30 d，結(jié)果顯示，產(chǎn)蛋量在免疫后第4天開始下降，下降2~3個百分點(diǎn)，然后逐漸恢復(fù)，到第10天已經(jīng)基本恢復(fù)到同組鴨免疫前的產(chǎn)蛋率。在種鴨免疫后4~6 d內(nèi)每組隨機(jī)抽取80枚入孵蛋，統(tǒng)計孵化率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫組與對照組無明顯差異，說明疫苗對免疫后30 d內(nèi)產(chǎn)蛋鴨的產(chǎn)蛋率和免疫后4~6 d入孵蛋的孵化率無明顯影響。

攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，低劑量組保護(hù)率為70%，中、高劑量組與商品活疫苗組的保護(hù)率均為100%，非免疫對照組雛鴨均表現(xiàn)為典型的DTMUV感染癥狀，其中4只死亡。說明重組亞單位疫苗能夠很好地保護(hù)免疫鴨免受DTMUV的攻擊，達(dá)到與商品活疫苗相同的保護(hù)效果。以上結(jié)果表明，該重組亞單位疫苗具有良好安全性及保護(hù)性。本研究為該疫苗的進(jìn)一步擴(kuò)大臨床試驗(yàn)及推廣應(yīng)用打下了一定的基礎(chǔ)。