王兆博 劉 瑩 曹洪欣

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；3.中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)，北京 100029）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ê?jiǎn)稱冠心?。–HD）指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞、冠狀動(dòng)脈微血管功能障礙或冠狀動(dòng)脈痙攣，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病。《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》報(bào)道我國(guó)心血管病患者達(dá)2.9億，其中冠心病1 100萬(wàn)，占總死亡人數(shù)4成以上［1-2］。美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)（AHA）指南推薦的藥物治療方案局限于改善癥狀及通過(guò)降脂穩(wěn)斑、抗血小板而減少心臟不良事件發(fā)生，尚無(wú)能夠治愈冠心病的藥物［3］。

曹洪欣教授經(jīng)過(guò)30余年臨床實(shí)踐與研究，創(chuàng)建溫陽(yáng)益心法（溫心方）治療冠心病，方劑由黨參、麥冬、黃連、半夏、瓜蔞、薤白、桂枝、赤芍等組成。研究顯示此法可調(diào)節(jié)多種凝血酶因子，抑制內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，降低血脂，緩解心絞痛（硝酸甘油停減率94.74%），逆轉(zhuǎn)心電圖ST-T改變，改善冠狀動(dòng)脈狹窄狀態(tài)［4-5］。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)結(jié)合的方法探討溫心方法治療冠心?。ㄐ乇裕┳饔脵C(jī)制，為揭示溫心方作用機(jī)理提供科學(xué)支撐。

1 資料與方法

1.1 方藥成分化合物與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）對(duì)溫心方各中藥組分和靶蛋白信息進(jìn)行檢索，以O(shè)B值（生物利用度）≥30%及DL值（成分相似性）≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。將靶蛋白信息錄入U(xiǎn)niprot網(wǎng)站（http：//www.uniprot.org/），檢索藥物靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名。將數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件，構(gòu)建“中藥-化合物-靶基因”可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化疾病靶基因篩選 登錄基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)冠心病靶點(diǎn)基因進(jìn)行查詢，關(guān)鍵檢索詞為：“Coronary vasospasm”“coronary stenosis”“coronary artery disease”“coronary disease”“coronary atherosclerosis”“coronary thrombosis”?；驍?shù)據(jù)庫(kù)詳見(jiàn)表 1。

1.3 韋恩圖與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建 將藥物、疾病的靶基因錄入微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）制作韋恩圖，得到疾病與藥物交集靶點(diǎn)，將其導(dǎo)入String網(wǎng)站及Cytoscape 3.5.1構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用兩種方法對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行篩選與分析：1）篩選度值（degree）排名前20的靶點(diǎn)；2）關(guān)聯(lián)系數(shù)篩選法：根據(jù)BC、DC、CC、NC、LAC、EC中位數(shù)對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行篩選并選出排名前20的靶點(diǎn)。通過(guò)以上兩種方法綜合分析并選出核心靶點(diǎn)。

1.4 GO與KEGG通路富集分析 將藥物與疾病交集基因錄入 Metascape網(wǎng)站（http：//metascape.org/）進(jìn)行GO及KEGG分析。篩選出與冠心病相關(guān)的通路，篩選出核心通路，并予以可視化。

1.5 分子對(duì)接及圖形可視化 運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)關(guān)鍵化合物-靶點(diǎn)作用關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。檢索PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）及ZINK數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//zinc.docking.org/）下載核心靶點(diǎn)蛋白及與化合物分子文件，導(dǎo)入AutoDock4.2、PyMOL2.3.2進(jìn)行分子對(duì)接可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 溫心方有效成分篩選 詳見(jiàn)表2（僅列出部分藥物成分）。共篩選出97種藥物化合物，其中黨參21種，麥冬18種，半夏12種，赤芍13種，瓜蔞11種，薤白10種，桂枝6種，黃連14種。

表2 方劑有效成分信息表

續(xù)表2

2.2 藥物化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 見(jiàn)圖1。整合檢索基因數(shù)據(jù)并去重后得到196個(gè)藥物基因靶點(diǎn)，化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共包含285個(gè)節(jié)點(diǎn)，988條邊。排名前5個(gè)藥物成分度值分別是：β-谷甾醇（D）125，豆甾醇（A）117，柚皮素（XB9）97，7-甲氧基-2-甲基異黃酮（DS5）45，槲皮素（C）43。

圖1 藥物化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 藥物與疾病的靶點(diǎn)韋恩圖 見(jiàn)圖2。共篩選出疾病靶點(diǎn)基因3 127個(gè)，溫心方作用靶點(diǎn)196個(gè)，藥物與疾病重疊靶點(diǎn)123個(gè)。

圖2 藥物與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 藥物與疾病PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 見(jiàn)表3，圖3。通過(guò)String網(wǎng)站及Cytoscape3.5.1構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)共包含745個(gè)節(jié)點(diǎn)，10 303條邊。根據(jù)BC、DC、CC、NC、LAC、EC中位數(shù)及Degree篩選，排名前十的基因靶點(diǎn)。

圖3 藥物與疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表3 核心靶點(diǎn)篩選表

2.5 GO及KEGG富集分析 見(jiàn)表4，圖4～6。通過(guò)富集分析共預(yù)測(cè)出131條通路，篩選出與冠心病關(guān)聯(lián)最密切的14條通路。

表4 冠心病相關(guān)通路表

圖4 GOBP、GOCC、GOMF氣泡圖

圖5 KEGG通路氣泡圖

圖6 PI3K-Akt通路圖

2.6 分子對(duì)接與可視化驗(yàn)證 見(jiàn)表5，圖7。本研究對(duì)KDR、VEGFA、NOS3、PTGS2進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，各分子間binding energy均小于0，說(shuō)明分子間具有結(jié)合趨勢(shì)。

圖7 分子對(duì)接圖

表5 分子對(duì)接表信息表

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)交互作用將“藥物-靶點(diǎn)”與“疾病-基因”進(jìn)行關(guān)聯(lián)拓?fù)?，揭示化合物與靶點(diǎn)間的潛在互作關(guān)系，為中藥方劑作用機(jī)制研究提供了高效的方法。本研究共篩選出溫陽(yáng)益心法（溫心方）97種藥物成分，度值（Degree）排名前5的化合物為β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、柚皮素（naringenin）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、槲皮素（quercetin）；獲得藥物與疾病重疊靶點(diǎn)123個(gè)；分子對(duì)接結(jié)果顯示KDR、VEGFA、NOS3、PTGS2與對(duì)應(yīng)的化合物之間的結(jié)合能均小于0，說(shuō)明其存在結(jié)合趨勢(shì)；通過(guò)富集分析共篩得PI3KAkt、NF-κB、剪切力與動(dòng)脈硬化、HIF-1共4條與冠心病相關(guān)的通路。

本研究采用關(guān)聯(lián)系數(shù)及度值法篩選核心靶點(diǎn)，將兩種方法所得出的靶點(diǎn)、通路、化合物進(jìn)行整合分析，結(jié)果顯示核心靶點(diǎn)集中分布于PI3K-Akt、NF-κB、剪切力與動(dòng)脈硬化、HIF-1這4條通路，度值較高的化合物多作用于PI3K-Akt通路，例如β-谷甾醇、豆甾醇、小檗堿作用于PTGS2，槲皮素、小檗堿作用于NOS3，7-甲氧基-2-甲基異黃酮作用于GSK3B、NOS3，鹽酸巴馬汀作用于KDR、VEGFA、KIT等，而作用于PTGS2的化合物最多，共32個(gè)。

豆甾醇（Stigmasterol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、柚皮素（naringenin）是溫心方治療冠心病的關(guān)鍵化合物，能夠保護(hù)血管內(nèi)皮，改善線粒體功能，減少氧自由基（ROS）的聚積，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)［6-8］。已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)上述化合物具有延緩動(dòng)脈硬化、逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣斑塊的作用［9-10］。豆甾醇與β-谷甾醇均屬固醇類化合物，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽固醇（TC）的吸收，抑制炎癥過(guò)程中巨噬細(xì)胞對(duì)修飾脂蛋白攝取、斑塊內(nèi)炎癥及脂質(zhì)沉積［11］。柚皮素是薤白的主要成分之一，可降低主動(dòng)脈段MCP-1和VCAM-1等基因的表達(dá)，抑制脂質(zhì)條紋形成，阻滯血管平滑肌細(xì)胞體外增殖及遷移［12］。槲皮素（quercetin）結(jié)構(gòu)中存在活性羥基，可以減少活性氧（ROS）的形成，抑制環(huán)氧合酶（COX）和脂氧合酶（LOX）活性，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)活性［13］。

磷脂酰肌醇3-激酶蛋白（PI3K-Akt）通路可廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種調(diào)節(jié)功能，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在內(nèi)皮細(xì)胞增殖過(guò)程中起關(guān)鍵作用［14］，可引起PI3K磷酸化成為肌醇磷脂產(chǎn)物并激活下游的Akt。激活的PI3K-Akt通路能抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移，減少血小板附著，調(diào)控血管內(nèi)皮組織因子表達(dá)，從而起到保護(hù)內(nèi)皮的作用［15］。溫陽(yáng)益心法（溫心方）可上調(diào)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化大鼠PI3K-Akt通路中PI3Kp80、NOS3編碼的eNOS蛋白表達(dá)及AKT的磷酸化［16］。在缺氧的狀態(tài)下，NOS3可通過(guò)活化的PI3KMAPK信號(hào)誘導(dǎo)HIF-1促進(jìn)心血管再生，調(diào)整代謝性應(yīng)激反應(yīng)，從而適應(yīng)缺血的環(huán)境［17］。

本研究的局限性，第一，PI3K-Akt等關(guān)鍵通路及其靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；第二，目前不同數(shù)據(jù)庫(kù)缺少統(tǒng)一的靶點(diǎn)篩選標(biāo)準(zhǔn)，本研究雖對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析與論證，結(jié)果與實(shí)際情況仍存在差異性的可能。

綜上所述，β-谷甾醇、豆甾醇、小檗堿、槲皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、柚皮素、鹽酸巴馬汀可能是溫陽(yáng)益心法（溫心方）治療冠心病的關(guān)鍵化合物，其可能通過(guò)作用于VEGFA、NOS3、PTGS2、KDR等靶點(diǎn)對(duì)PI3KAkt、NF-κB、HIT-1等通路進(jìn)行調(diào)控，而PI3K-Akt可能是溫陽(yáng)益心法（溫心方）治療冠心病的核心通路。