王北南，宋曉，賀琳娟，錢永忠，邱靜

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和工業(yè)化進(jìn)程的加快，工、農(nóng)、畜牧、水產(chǎn)等行業(yè)中人類活動的加劇使得水體中涌現(xiàn)了大量新型有機(jī)污染物。水是生命之源，水體中的污染物通過長距離遷移和食物鏈富集作用最終將會進(jìn)入人體，對人體健康造成極大的威脅，已經(jīng)成為研究重點[1]。

莠去津是一種三嗪類除草劑，在20 世紀(jì)50 年代投入商業(yè)化，目前已經(jīng)成為世界上第二大消費使用的除草劑[2]。由于其用量大、具有中等水溶性且對土壤吸附性低，通常殘留于水環(huán)境中[3]，已經(jīng)在世界各地的水體中被發(fā)現(xiàn)。20 世紀(jì)70 年代對灌溉尾水回收坑內(nèi)的土壤及水檢測發(fā)現(xiàn)，莠去津殘留相較于其他農(nóng)藥更頻繁、更持久，其中在水中檢測到的最大含量為1 074.1 μg·L?1[4]，相關(guān)調(diào)查顯示，發(fā)展中國家比發(fā)達(dá)國家地表水中的莠去津濃度更高[5]。莠去津具有發(fā)育毒性、內(nèi)分泌和抗氧化系統(tǒng)干擾效應(yīng)，以及生殖毒性等，會誘導(dǎo)大鼠的紅細(xì)胞氧化損傷[6]，引起斑馬魚胚胎谷胱甘肽S?轉(zhuǎn)移酶（GST）活性增強(qiáng)[7]，引起胎鼠[8]、美洲蟾蜍、林蛙及非洲爪蟾幼體[9]生長發(fā)育遲緩，降低斑馬魚卵的孵化率[10]，誘導(dǎo)仔鼠的下丘腦以上神經(jīng)元損傷等[11]。多環(huán)芳烴（PAHs）是一類稠環(huán)芳香族化合物，廣泛存在于石油、煤炭中，目前也是水體中一類典型的持久性有機(jī)污染物。多環(huán)芳烴難以降解，具有遠(yuǎn)距離遷移性和生物積累性[12]，其中芴（Flu）是美國環(huán)保總局優(yōu)先控制的16 種多環(huán)芳烴之一。我國水體環(huán)境中檢出率較高的多環(huán)芳烴是芴、萘、菲，其中再生水中芴檢出量最高[13]。芴目前已被證實具有神經(jīng)毒性、抗氧化酶系統(tǒng)干擾效應(yīng)等，會影響SOD、CAT的活性從而嚴(yán)重影響斑馬魚抗氧化酶系統(tǒng)[14]，導(dǎo)致斑馬魚非極性麻痹作用，細(xì)胞中毒并失去活性[15]，同時，芴及其代謝物會到達(dá)大鼠腦室，引起大鼠產(chǎn)生焦慮等行為障礙[16]。

斑馬魚成本低、繁殖周期短、胚胎透明且發(fā)育同步，與人類基因組具有高度同源性，具有敏感的發(fā)育階段，已成為毒理學(xué)研究中重要的模型生物[17]。在開展斑馬魚相關(guān)研究時，代謝組學(xué)技術(shù)通過研究生物機(jī)體整體代謝情況的變化，在解釋低劑量環(huán)境污染物對生物體響應(yīng)機(jī)制方面發(fā)揮了重要作用[18]。水體環(huán)境中的污染物通常以混合物形式存在，多環(huán)芳烴和三嗪類除草劑作為水體中常見的有機(jī)污染物，其混合污染情況已經(jīng)受到了人們的重視[19]。與單一污染物相比，混合污染物可能導(dǎo)致生物體內(nèi)更復(fù)雜的毒性加和、協(xié)同增強(qiáng)等相互作用[20]，而目前針對莠去津和芴等水體污染物的聯(lián)合毒性研究相對較少。因此，本文研究了莠去津和芴對斑馬魚胚胎的聯(lián)合毒性，利用模型預(yù)測污染物在表型異常上聯(lián)合作用方式，并基于靶向代謝組學(xué)技術(shù)，探討其對氨基酸代謝的擾亂影響，篩選毒性敏感代謝物，從而解析污染物對斑馬魚胚胎的毒性機(jī)制，以期為評估水體混合污染風(fēng)險和水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 斑馬魚胚胎的獲得與培養(yǎng)

控制野生AB 型雌雄斑馬魚成魚（購自國家斑馬魚資源中心，China Zebrafish Resource Center，CZRC）的日夜節(jié)律：晝 14 h，夜 10 h，采卵前一天 20：00—21：00 點將雌雄斑馬魚成魚隔開，次日上午8：00—9：00 點使性成熟的雌雄斑馬魚成魚以1∶1 比例自然交配，受精后3 h 時，收集受精卵并用胚胎培養(yǎng)液清洗，選擇處于同一發(fā)育階段且發(fā)育正常的胚胎置于培養(yǎng)液中，于28.5 ℃的條件下恒溫控光培養(yǎng)，待后續(xù)實驗研究。胚胎培養(yǎng)液為凈化水，其理化性質(zhì)為：溫度（28±1）℃，pH 7.0±0.1，硬度 75~200 mg·L?1，電導(dǎo)率（500±1）μS·cm?1。

1.2 試劑與儀器

莠去津和芴標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）購自天津阿爾塔科技有限公司，由于暴露于0.1%二甲基亞砜（DMSO，純度99.9%，購自北京百靈威科技有限公司）不會影響實驗結(jié)果，因此將莠去津和芴溶于DMSO中，配制為 25 000 mg·L?1的儲備溶液，?20 ℃避光儲存，用胚胎培養(yǎng)液稀釋該儲備液以獲得系列濃度污染物暴露溶液。甲醇（Fisher，色譜級）購自北京化標(biāo)源科技有限公司。甲基纖維素（Sigma?Aldrich）購自北京雁棲灣生物技術(shù)有限公司。

實驗儀器包括顯微鏡（SZX2?ILLT，奧林巴斯，日本）、人工氣候箱（RXM 智能型，寧波江南儀器廠，中國寧波）、液相色譜?三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀（QTRAP 6500+，美國SCIEX 公司）、高速冷凍離心機(jī)（ST 16R，美國ThermoFisher 公司）、多管渦旋振蕩儀（SCDEALL VX?III，北京踏錦科技有限公司）、超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）、超聲波儀（Q800R3，美國Qsonica公司）。

1.3 斑馬魚胚胎的暴露

于6 孔板中加入3 mL 胚胎培養(yǎng)液，每孔加入30個斑馬魚胚胎，加入3 μL 不同濃度污染物暴露溶液（保證DMSO 濃度小于0.1%）；另設(shè)置添加胚胎培養(yǎng)液、0.1% DMSO 的處理組，分別為空白對照組、溶劑對照組，每個處理設(shè)置3 個平行重復(fù)。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，莠去津和芴對斑馬魚胚胎的120 h?LC50（半致死濃度）分別為11.90 mg·L?1和15.07 mg·L?1，單一暴露溶液濃度設(shè)置為 1/16LC50、1/8LC50、1/4LC50、1/2LC50和LC50（表1）。持續(xù)培養(yǎng)120 h，每24 h 觀察并記錄斑馬魚的死亡情況以及斑馬魚胚胎的組織病變情況，移除死魚和脫落的胚胎膜；培養(yǎng)結(jié)束后，用甲基纖維素凝膠將仔魚固定在玻璃片上，用照相顯微鏡觀察統(tǒng)計斑馬魚的死亡情況及各組織器官發(fā)育情況。

表1 單一暴露時莠去津和芴暴露溶液濃度（mg·L?1）Table 1 Concentrations of atrazine and fluorene exposed to a single exposure（mg·L?1）

1.4 靶向氨基酸代謝組學(xué)分析

樣品前處理方法參考文獻(xiàn)[21]，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。收集20 條處理120 h 后的斑馬魚仔魚至2 mL 凍存管中，用胚胎培養(yǎng)液清洗3 遍，吸干水分，用液氮快速冷凍后，放置于?80 ℃環(huán)境下保存，每個處理組設(shè)置6個平行處理。樣品解凍后，加入180μL預(yù)冷的甲醇水混合溶液（體積比為10∶8），0 ℃下進(jìn)行超聲波破碎處理，然后加入300μL 甲醇和280μL 超純水，渦旋振蕩1 min，使目標(biāo)物充分溶出。加入400μL二氯甲烷，除去脂肪和其他脂溶性雜質(zhì)。超聲提取10 min，在 4 ℃、10 000 r·min?1轉(zhuǎn)速下離心 10 min，取上清液過0.22 μm 濾膜，上機(jī)檢測。本實驗采用的儀器方法參考文獻(xiàn)[22]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0 軟件處理，組間采用單因素方差（ANOVA）分析，組內(nèi)采用Tamhane′s T2 檢驗，顯著性水平為P<0.05，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用Origin 9.0 進(jìn)行熱圖繪制、非線性擬合計算污染物的受試動物半數(shù)產(chǎn)生效應(yīng)變化的濃度（EC50）等。分別采用藥物相互作用研究中常用的濃度相加（CA）法、毒理作用（IA）法和聯(lián)合指數(shù)（CI）法3種模型對莠去津和芴二元聯(lián)合效應(yīng)進(jìn)行預(yù)測和擬合優(yōu)度估計。CA模型基于混合成分具有相同或相似的作用位點和作用模式（MOA），近年來，已在混合物對生態(tài)環(huán)境和人類健康風(fēng)險評估中廣泛應(yīng)用[23]。IA 模型則適用于具有不同MOA 的二元混合物[24]。CA 模型和IA模型均假設(shè)混合物組分之間無相互作用，而CI模型則不依賴于MOA，可以定性地評估混合物之間的相互作用，并定量地評估相互作用的程度，因而被廣泛用于聯(lián)合毒性研究，CI 等于1、小于1 和大于1 分別表示加和作用、協(xié)同作用和拮抗作用[25]。在醫(yī)學(xué)上，劑量減少指數(shù)（DRI）表示為了達(dá)到相同作用水平，聯(lián)合使用兩種藥物相比單獨使用時每種藥物劑量減少的倍數(shù)，DRI 值越大，劑量減少越多[26]。使用 CompuSyn 軟件計算CI值和DRI值。使用SIMCA?P 14.1進(jìn)行多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和差異代謝物的篩選[變量重要性投影（VIP）>1，P<0.05]。 使 用 MetaboAnalyst（https：//www.metaboanalyst.ca）在線軟件進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 莠去津和芴對斑馬魚胚胎的毒性比較

受精后3 h的斑馬魚胚胎分別暴露于莠去津和芴120 h后，仔魚出現(xiàn)了組織器官發(fā)育異常情況，均能觀察到卵黃囊異常（主要表現(xiàn)為卵黃囊吸收延遲/水腫）和脊柱彎曲異常（圖1）。根據(jù)異常發(fā)生率與暴露溶液濃度的非線性擬合，計算出莠去津?qū)Π唏R魚仔魚120 h卵黃囊異常和脊柱彎曲的EC50分別為12.39 mg·L?1和23.43 mg·L?1，芴為 3.10 mg·L?1和 13.89 mg·L?1。由此可見，這兩個毒性指標(biāo)中，在低濃度即有較強(qiáng)毒性效應(yīng)的卵黃囊異常更為敏感，且芴的毒性明顯高于莠去津。

分別以莠去津和芴對斑馬魚仔魚產(chǎn)生卵黃囊異常和脊柱彎曲的 1/8EC50、1/4EC50、1/2EC50、EC50、2EC50濃度混合兩種污染物（表2），并暴露處理受精后3 h斑馬魚胚胎120 h 后觀察發(fā)現(xiàn)，隨著二元混合物濃度的增大，兩個毒性指標(biāo)的發(fā)生率均增加（圖2）。在中低濃度下，聯(lián)合暴露引起仔魚卵黃囊異常的發(fā)生率顯著高于脊柱彎曲，而在高濃度下情況則相反。這表明在中低濃度下，卵黃囊異常是更為敏感的聯(lián)合毒性指標(biāo)。

表2 聯(lián)合暴露時莠去津和芴的濃度（mg·L?1）Table 2 Concentrations of fluorene and atrazine in binary mixed exposure solution（mg·L?1）

2.2 莠去津和芴的聯(lián)合作用方式

利用模型預(yù)測不同濃度下二元混合物引起的斑馬魚胚胎異常率，并與實際試驗觀察值進(jìn)行比較，結(jié)果見圖3。由圖可知，不同模型針對混合物預(yù)測評估能力具有一定差異，CI 模型的劑量?效應(yīng)關(guān)系與實際試驗觀察值較為吻合，預(yù)測能力優(yōu)于CA 和IA 模型，因此本研究選用CI 模型對莠去津和芴的聯(lián)合作用方式進(jìn)行預(yù)測。

總體而言，CI 值隨著混合物濃度的升高而增大（圖4），表明毒性效應(yīng)不斷增強(qiáng)。對于卵黃囊異常，CI 值隨著濃度增加由小變大，當(dāng)混合濃度為0.489 mg·L?1、效應(yīng)為 20% 時，CI=1，此后混合濃度再增大時，聯(lián)合作用由協(xié)同轉(zhuǎn)為拮抗作用。而對于脊柱彎曲，CI 值變化趨勢則相反，由拮抗作用轉(zhuǎn)變?yōu)閰f(xié)同作用，當(dāng)混合濃度為13.495 mg·L?1、效應(yīng)為35%時，CI=1?？梢姼邉┝克较拢旌衔镆鸺怪鶑澢娘L(fēng)險加劇。

通過聯(lián)合毒性作用的效應(yīng)，即受影響分?jǐn)?shù)（Fa）與劑量減少指數(shù)（DRI）繪制相互作用中值圖（圖5），發(fā)現(xiàn)對于聯(lián)合暴露引起的卵黃囊異常和脊柱彎曲，分別當(dāng) Fa<0.2 和 Fa>0.3 時，莠去津和芴的所有 lg（DRI）值均大于0（圖5），即二元混合暴露比單一暴露在更低的劑量即可導(dǎo)致同樣的毒性效應(yīng)。隨著卵黃囊異常效應(yīng)的減小或脊柱彎曲效應(yīng)的增加，莠去津和芴的DRI 值都顯著提高，表明不管是低劑量還是高劑量下，二元混合物都比單一作用時毒性風(fēng)險更高。

2.3 靶向氨基酸代謝組學(xué)分析

對空白對照組、莠去津和芴單一暴露組（1/2LC50）以及聯(lián)合暴露組（按1/2LC50毒性單位1∶1混合二元污染物）的斑馬魚仔魚中22 種氨基酸進(jìn)行分析（圖6），首先通過主成分分析（PCA）得到PCA?X 得分圖，結(jié)果顯示處理組和空白對照組之間分布均可完全分開，表明污染物的暴露處理在氨基酸代謝水平上對斑馬魚仔魚產(chǎn)生了一定影響。然后使用正交偏最小二乘判別法（OPLS?DA）分析，由OPLS?DA 得分圖可知，暴露組與對照組空間分布差異更大，且莠去津單一暴露組、聯(lián)合暴露組與對照組的分離情況更好，說明二者聯(lián)合可能對斑馬魚仔魚的氨基酸代謝有更大的干擾。由單一以及聯(lián)合暴露組、空白對照組的22 種氨基酸代謝物熱圖（圖7）可知，暴露處理引起了部分氨基酸代謝物的含量改變，兩個污染物單一暴露之間存在一定差異。與空白對照組相比，莠去津單一暴露和聯(lián)合暴露主要引起了斑馬魚仔魚氨基酸代謝物的上調(diào)（L?正纈氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、組氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、精氨酸），而芴單一暴露則主要引起部分氨基酸下調(diào)（L?正纈氨酸、L?正亮氨酸、γ?氨基丁酸、天冬酰胺、天冬氨酸、酪氨酸、谷氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、精氨酸）。

為了篩選出能更好地反映污染物影響的差異代謝物，將對照組分別與暴露組進(jìn)行比較，在OPLS?DA分析結(jié)果中篩選VIP>1.0 且P<0.05 的差異代謝物。與對照組相比，莠去津單一暴露后的斑馬魚仔魚出現(xiàn)了9 種發(fā)生顯著性變化的代謝物，包括天冬酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、精氨酸、組氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和正纈氨酸；芴單一暴露后篩選到甘氨酸、色氨酸、蛋氨酸、γ?氨基丁酸、谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸、天門冬氨酸、組氨酸、天冬酰胺、一磷酸腺苷和蘇氨酸12 種差異代謝物；聯(lián)合暴露后篩選出苯丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸、谷氨酸、一磷酸腺苷和酪氨酸6 種差異代謝物。進(jìn)一步進(jìn)行代謝通路分析（圖8），發(fā)現(xiàn)污染物暴露均影響了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；單一暴露均影響了甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和組氨酸代謝。莠去津單一暴露和聯(lián)合暴露均影響了苯丙氨酸代謝和氨?；?tRNA 的生物合成；芴單一暴露和聯(lián)合暴露均影響了D?谷氨酰胺和D?谷氨酸代謝。除此之外，莠去津單一暴露還影響了半胱氨酸和蛋氨酸的代謝；芴單一暴露還影響了丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝和精氨酸生物合成；聯(lián)合暴露還影響了谷胱甘肽、乙醛酸、二羧酸的代謝。

3 討論

本研究對水體中典型有機(jī)污染物莠去津和芴對斑馬魚胚胎的聯(lián)合毒性進(jìn)行了探索。研究結(jié)果表明，當(dāng)受精后3 h 斑馬魚胚胎單一暴露于莠去津或芴120 h 后，均觀察到明顯的卵黃囊吸收延遲、水腫和脊柱彎曲等異常發(fā)育情況，因此選擇這兩個毒性終點進(jìn)行后續(xù)的聯(lián)合毒性研究。卵黃是斑馬魚開始進(jìn)食前的營養(yǎng)來源，而卵黃囊異常（如水腫）是斑馬魚發(fā)育毒性篩查中常見的指標(biāo)，包括多環(huán)芳烴在內(nèi)的多種有毒物質(zhì)已被證明可引起斑馬魚胚胎的卵黃囊水腫[27]。卵黃囊水腫可能是由水滲透屏障失衡引起的[28]，而水滲透調(diào)節(jié)由鰓和消化系統(tǒng)維持[29]，卵黃囊吸收延遲表明斑馬魚在營養(yǎng)吸收方面出現(xiàn)問題，這可能造成進(jìn)一步的生長發(fā)育阻滯等干擾，相似的現(xiàn)象也在非洲爪蟾和受精后72 h 斑馬魚胚胎中被觀察到[15，30]。脊柱彎曲可能是由骨骼發(fā)育不良或神經(jīng)系統(tǒng)被破壞引起的，且通常會導(dǎo)致斑馬魚運動受損[31]。卵黃囊異常是中低濃度下二元聯(lián)合暴露更為敏感的聯(lián)合毒性指標(biāo)，說明莠去津和芴的毒性可能干擾斑馬魚胚胎的鰓和消化系統(tǒng)的生長發(fā)育，進(jìn)而造成其他發(fā)育畸形。

本研究發(fā)現(xiàn)，CA 和IA 模型的預(yù)測值均高于實驗值，表明莠去津和芴之間可能存在相互作用。CI 指數(shù)隨二元混合物濃度的變化在兩個毒性指標(biāo)上呈現(xiàn)不同的趨勢，在低劑量水平下，二元混合物傾向于引起卵黃囊異常，高劑量水平下則傾向于引起脊柱彎曲。在相同類型的毒性指標(biāo)上，莠去津和芴的作用是不同的，因此，當(dāng)二者以一定的濃度比例混合時，它們可能會相互作用。隨著混合暴露劑量的增加，卵黃囊異常毒性作用由協(xié)同轉(zhuǎn)為拮抗，而脊柱彎曲毒性則出現(xiàn)相反的趨勢，可見不同劑量下的聯(lián)合毒性作用表現(xiàn)形式不同。污染物間的聯(lián)合作用方式往往比較復(fù)雜，例如，有研究表明，同樣是典型水體污染物的全氟辛酸和全氟辛烷磺酸表現(xiàn)出更加復(fù)雜的相互作用，從協(xié)同作用轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓棺饔茫詈笥洲D(zhuǎn)變?yōu)閰f(xié)同作用[32]。當(dāng)多種農(nóng)藥殘留污染共同產(chǎn)生“1+1>2”的協(xié)同作用時，混合污染物的生態(tài)毒理效應(yīng)和風(fēng)險評估更應(yīng)當(dāng)引起重視，其復(fù)雜的毒性機(jī)理也有待深入研究。

靶向氨基酸代謝組分析結(jié)果表明，莠去津和芴的單一和聯(lián)合暴露均對斑馬魚仔魚的氨基酸代謝產(chǎn)生了一定干擾，造成部分氨基酸上調(diào)或下調(diào)。在22 種氨基酸中篩選出差異代謝并進(jìn)行代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合和單一暴露對代謝通路的影響也有異同。其中，單一污染物暴露均影響了甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和組氨酸代謝，這可能反映了斑馬魚仔魚體內(nèi)的氧化應(yīng)激、磷脂的合成、能量代謝及抗炎反應(yīng)受到一定影響。莠去津單一暴露和聯(lián)合暴露處理還影響了氨酰基?tRNA 的生物合成，說明細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能可能受損。芴單一暴露和聯(lián)合暴露均影響了D?谷氨酰胺和D?谷氨酸代謝，谷氨酸是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，并參與谷氨酰胺的合成，而谷氨酰胺具有免疫調(diào)節(jié)和提高抗氧化能力的作用[33]，因此谷氨酰胺和谷氨酸代謝受干擾可能會影響斑馬魚仔魚神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育。另外，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成在聯(lián)合和單一暴露后均受到干擾，這3 種芳香族氨基酸參與斑馬魚的神經(jīng)發(fā)育，苯丙氨酸是酪氨酸的前體物質(zhì)，而酪氨酸和色氨酸是多種神經(jīng)遞質(zhì)的前體，如多巴胺、五羥色氨酸、血清素和褪黑素，它們的代謝紊亂會影響神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞[34?35]，因此苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成受干擾引起的神經(jīng)系統(tǒng)受損可能是斑馬魚仔魚出現(xiàn)脊柱彎曲的原因。除此以外，莠去津單一暴露還影響了半胱氨酸和蛋氨酸的代謝，表明斑馬魚仔魚的機(jī)體防御機(jī)制和細(xì)胞凋亡機(jī)制可能受到影響；芴單一暴露還影響了丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝和精氨酸生物合成，可能反映斑馬魚仔魚體內(nèi)氧化應(yīng)激受到影響，神經(jīng)元、免疫和激素合成受損；聯(lián)合暴露還影響了谷胱甘肽、乙醛酸、二羧酸的代謝等途徑，表明聯(lián)合暴露可能使斑馬魚仔魚氧化應(yīng)激、能量代謝等生理功能受到干擾。這些因素可能是莠去津和芴造成斑馬魚仔魚出現(xiàn)卵黃囊異常和脊柱彎曲等異常的原因，但由于相關(guān)代謝物功能上的復(fù)雜性，其聯(lián)合毒性作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）莠去津和芴單一暴露120 h 后均會引起斑馬魚仔魚的卵黃囊異常和脊柱彎曲，其中卵黃囊異常這一指標(biāo)更為敏感，且芴的毒性明顯高于莠去津。

（2）二元混合暴露在引起卵黃囊異常和脊柱彎曲中分別呈現(xiàn)出拮抗作用和協(xié)同作用，中低濃度下卵黃囊異常可能是聯(lián)合毒性的敏感指標(biāo)，而高劑量水平下引起脊柱彎曲的風(fēng)險更高。無論低劑量還是高劑量，二元混合物都比單一作用時毒性風(fēng)險更高。

（3）靶向氨基酸代謝組分析及氨基酸差異代謝物的篩選和通路分析結(jié)果表明，污染物暴露干擾了斑馬魚仔魚甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和組氨酸代謝等途徑，表明其神經(jīng)發(fā)育、氧化應(yīng)激、抗炎機(jī)制、能量代謝、免疫和細(xì)胞凋亡機(jī)制等生理功能可能受到干擾，進(jìn)而影響了生長發(fā)育。