付嬈，尚博，張國友，馮兆忠

（南京信息工程大學應用氣象學院，江蘇省農(nóng)業(yè)氣象重點實驗室，南京 210044）

近地表臭氧（O3）是光化學煙霧的主要組成部分，由氮氧化物與一氧化碳（CO）、甲烷（CH4）和揮發(fā)性有機化合物（VOCs）等前體物經(jīng)過一系列的光化學氧化生成的二次污染物[1?2]。隨著工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展及人類活動的加劇，O3前體物排放的增加導致全球地表 O3濃度已經(jīng)從 19 世紀末的 10 nmol·mol?1上升到超過40 nmol·mol?1[3]，并將持續(xù)增加。在夏季，全球近四分之一的國家和地區(qū)正面臨近地層O3濃度高于60 nmol·mol?1的威脅[4]，超過 O3對植物的危害閾值（40 nmol·mol?1）[5]。O3污染已成為我國嚴重的生態(tài)環(huán)境問題[6]，尤其是長三角地區(qū)[7?8]。據(jù)統(tǒng)計[9]，O3污染導致長江三角洲地區(qū)水稻年平均減產(chǎn)量為2.445×109t，占實際產(chǎn)量的9.1%，造成年經(jīng)濟損失為10.27 億美元?？梢?，當前O3濃度已對我國水稻產(chǎn)量造成了嚴重損失。

地表O3是一種動態(tài)的、存在時間較短的空氣污染物，它直接通過氧化作用破壞細胞[10]，對敏感植物造成諸多不利影響[11]，有害于人類健康和植被生長。葉片是O3直接的危害器官，O3通過氣孔擴散進入葉片后會首先進入質(zhì)外體空間，在質(zhì)外液中溶解后與質(zhì)外體的物質(zhì)反應生成多種活性氧自由基（ROS），存在于質(zhì)外體中的抗氧化物質(zhì)作為第一道防線，將部分O3/ROS 解毒，而未與質(zhì)外體反應的O3/ROS 則進入共質(zhì)體內(nèi)，啟動次級解毒響應機制[12]。然而，在長時間高濃度的O3熏蒸下，一旦ROS 的累積量超過植物自身的解毒防御閾值，便會引起細胞程序性死亡[13]，從而加速葉片衰老[14]、降低葉綠素含量，導致光合速率下降[15?16]，抗氧化系統(tǒng)被破壞[17?18]，造成葉片可見損傷[11]，最終導致作物產(chǎn)量下降[19?20]，礦質(zhì)元素含量升高[21]，造成嚴重的經(jīng)濟損失[22]?？梢?，研究O3污染對作物的影響對于農(nóng)業(yè)環(huán)境保護和經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。

目前已開展了大量關(guān)于O3對水稻葉片生長[14]、生理生化[15，18]、產(chǎn)量[20]以及營養(yǎng)元素利用[21]影響的研究。AINSWORTH 等[23]通過整合分析發(fā)現(xiàn)當O3濃度平均升高到 62 nmol·mol?1時，水稻的光合速率降低 28%，氣孔導度（Gs）降低23%，最終導致產(chǎn)量下降14%。然而這些研究都是在水稻的整個生育期進行O3熏蒸，對不同生育期O3熏蒸對水稻生長的影響差異的研究較少。PANG 等[24]利用江都開放式 O3熏蒸（O3?FACE）平臺，在整個生育期對兩個水稻品種（汕優(yōu)63和武育粳3號）進行1.5倍大氣O3濃度熏蒸試驗，結(jié)果表明，汕優(yōu)63 比武育粳3 號光合及產(chǎn)量更敏感，但是兩個水稻品種在應對不同生育期O3熏蒸時是否有差別仍然未知。水稻是世界三大主要糧食作物之一，其中90%以上的水稻生長和消費均發(fā)生在亞洲[25]。考慮到作物不同生育期對O3的敏感性有所差異，因此探究不同生育期O3熏蒸對水稻的影響可為O3防護時段提供科學依據(jù)，從而在水稻生長的特定生育期采取精準的調(diào)控措施，最終為有效減緩O3污染對水稻造成的傷害提供理論依據(jù)?；诖?，本研究利用開頂式氣室（OTC）在水稻生長的不同生育期（分蘗拔節(jié)期和抽穗灌漿期）進行O3熏蒸試驗，探究兩個水稻品種（汕優(yōu)63 和武育粳3 號）在不同生育期暴露于相同的O3劑量下，植株生長及葉片光合特性的響應差異，為有效防治O3污染提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗區(qū)位于江蘇省揚州市江都區(qū)南京信息工程大學揚州綠色農(nóng)業(yè)研究與示范基地（119°43′E，32°25′N），屬亞熱帶季風氣候，該地2009—2018 年平均氣溫16.2 ℃，年平均降水量1 131.3 mm，年日照時間1 936.1 h，年無霜期>290 d，當?shù)貙嵭虚L期的稻麥輪作體系，是典型的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗在OTC 中進行，OTC 為高2.3 m、直徑4.8 m 的正八面柱體，頂部留有直徑約3 m 的開口。以潔凈的氧氣（O2）作為氣源，用O3發(fā)生器（HY003，濟南創(chuàng)成科技有限公司）產(chǎn)生O3，通過鼓風機（CX?125，上海全風實業(yè)有限公司）將混合空氣送入每個OTC 內(nèi)，最終使OTC 內(nèi)O3均勻分布。使用49i O3分析儀（美國Thermo Scientific 公司）對OTC 內(nèi)中心位置O3濃度進行實時監(jiān)測與記錄，根據(jù)OTC 內(nèi)O3濃度與設(shè)定目標O3濃度的差異，通過質(zhì)量流量計控制供應的O2流量來控制氣室內(nèi)O3的濃度。使用HOBO 氣象站（美國Onset Computers公司）每隔5 min監(jiān)測OTC內(nèi)外溫度、濕度及光合有效輻射參數(shù)，每日熏蒸時間最長為10 h（8：00—18：00），遇到雨天則關(guān)閉儀器停止通氣。

本試驗選用的兩種供試水稻品種分別為雜交稻汕優(yōu)63和粳稻武育粳3號，均是當?shù)仄毡榉N植的水稻品種。2020 年 5 月 20 日進行育苗，7 月 2 日將長勢一致的幼苗插秧至底部直徑22 cm、高31 cm 的圓形花盆中，花盆中所用土為當?shù)剞r(nóng)田土壤。同時將每個品種的各10 盆水稻隨機放入氣室內(nèi)，適應氣室內(nèi)的生長環(huán)境。

試驗設(shè)置2 個O3處理：CF（過濾大氣，使用活性碳吸附空氣中的O3）和NF40（環(huán)境大氣+40 nmol·mol?1O3），每個 O3處理設(shè)置 3 個 OTC 重復（n=3）。本試驗共設(shè)置3 種處理：CF，即水稻始終位于CF 氣室中；O3?1，即水稻在分蘗拔節(jié)期位于NF40 氣室進行O3熏蒸，其他生育期在CF 氣室中（O3熏蒸自7 月25日開始，8 月 25 日結(jié)束，共計熏蒸 32 d）；O3?2，即水稻在抽穗灌漿期位于NF40 氣室進行O3熏蒸，其他生育期在 CF 氣室中（O3熏蒸自 8 月 26 日開始，9 月 18日結(jié)束，共計熏蒸 24 d）。其中，O3?1 和 O3?2 處理下的O3累計劑量AOT40 值（試驗期間小時O3濃度超過40 nmol·mol?1的累計值）分別為（9.54±0.41）μmol·mol?1·h 和（9.61±0.23）μmol·mol?1·h，兩個水稻品種在分蘗拔節(jié)期和抽穗灌漿期暴露于近似相等的AOT40 中。此外，CF 處理的 AOT40 值為 0.49 μmol·mol?1·h。所有的試驗都在相同的 OTC 內(nèi)開展，試驗期間OTC 內(nèi)外溫度分別為32.8 ℃和30.4 ℃，相對濕度分別為72.4%和74.0%，雖然OTC 內(nèi)溫度比室外溫度高約2.4 ℃，但當前研究是比較不同O3處理的影響，不涉及室內(nèi)外比較。

1.3 指標測定

1.3.1 株高和比葉重指標測定

株高：9 月19 日在每個OTC 內(nèi)不同處理的水稻中各隨機選取2 盆植株，測量植株主莖基部到葉頂?shù)拈L度。

比葉重（LMA）：9月21日隨機取下每個OTC中不同處理的兩片水稻旗葉葉片，使用HP LaserJet MFP M227?M231 打印機掃描葉片，利用 Image J 計算葉片表面面積，之后將葉片裝入信封中放進80 ℃烤箱烘干至恒質(zhì)量，用萬分之一天平稱取其干質(zhì)量，比葉重（g·m?2）=葉片干質(zhì)量（g）/葉面積（m2）。

1.3.2 光合特性指標測定

采用 Li?6800 便攜式光合測定儀（美國 LI?COR公司）于 9 月19 日和20 日測定光合速率?CO2濃度響應曲線（A?Ci曲線），對不同CO2濃度對應的光合速率進行擬合，具體測定方法：晴天9：00—15：00 在每個OTC內(nèi)每個品種每種處理隨機選取兩盆植株，在飽和光下誘導15~30 min 后，選擇受光照條件好的旗葉葉片進行測定，共測定36條A?Ci曲線。參數(shù)設(shè)置如下：每條曲線設(shè)置12 個 CO2濃度，分別為400、300、200、100、60、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600μmol·mol?1，光合有效輻射設(shè)置為 1 500 μmol·m?2·s?1，葉室溫度控制在（32±2）℃，空氣相對濕度為50%±5%。隨后從每條曲線的數(shù)據(jù)中挑選出第一個CO2濃度為400 μmol·mol?1時的葉片的氣體交換參數(shù)和葉綠素a 熒光參數(shù)作為光飽和下的光合作用特征數(shù)據(jù)。其中氣體交換參數(shù)包括飽和光合速率（Asat）、Gs 和胞間 CO2濃度（Ci），葉綠素 a 熒光參數(shù)包括：PSⅡ反應中心激發(fā)能捕獲效率（F′v/F′m）、光化學淬滅系數(shù)（qP）、PSⅡ?qū)嶋H光化學量子效率（PhiPS2）。根據(jù)SHARKEY 等[26]的方法擬合確定最大羧化速率（Vcmax）和最大電子傳遞速率（Jmax），并將Vcmax和Jmax的值校準到25 ℃。氣孔限制值（Ls）=1?胞間CO2濃度（μmol·mol?1）/大氣 CO2濃度（μmol·mol?1）。

1.3.3 光合色素指標測定

光合色素的測定：9月21日選取完成測定光合速率的葉片，用打孔器取直徑為0.7 cm的圓形葉片放入2 mL 95%的乙醇中浸泡，并放入4 ℃冰箱中黑暗保存，直至完全褪色。將提取液分別于664、649 nm 與470 nm 處測定吸光度，根據(jù)LICHTENTHALER[27]的方法得到葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）、葉綠素總量（Chl a+b）和類胡蘿卜素（Car）的含量。

1.3.4 葉片氮含量指標測定

將已烘干至固定質(zhì)量的葉片放在球磨儀中進行研磨，使用元素分析儀（Flashsmart CN，意大利）測定單位質(zhì)量的葉片氮含量（Nmass），單位面積的葉片氮含量（Narea，g·m?2）=單位質(zhì)量葉片氮含量（mg·g?1）×比葉重（g·m?2）×10?3。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)先用Excel 2010進行初步整理，經(jīng)SPSS 23.0 檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性與方差齊性后，運用JMP 10.0進行不同品種和處理間的雙因素方差分析，采用Tukey?Kramer HSD進行檢驗，分析不同處理間的差異顯著性。運用Sigmaplot 14.0做圖，柱形圖中的數(shù)據(jù)為平均值±標準差（SD），統(tǒng)計結(jié)果（P值）附圖中。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育期臭氧熏蒸對水稻株高和比葉重的影響

不同時期O3熏蒸導致兩種水稻的株高顯著降低（P<0.01）。綜合所有處理，汕優(yōu)63 的平均株高比武育粳3 號高36.5%且達到顯著性差異（P<0.01）。與CF 相比，O3?1和O3?2處理導致汕優(yōu)63的株高分別下降7.5%和6.9%，武育粳3 號的株高分別下降4.5%和3.3%，其中汕優(yōu)63的降幅達到顯著水平（圖1）。兩種供試水稻的LMA值在不同處理間無顯著性差異，株高和LMA值均未出現(xiàn)處理和品種間的顯著交互作用。

2.2 不同生育期臭氧熏蒸對水稻葉片光合特性參數(shù)的影響

不同生育期O3熏蒸導致兩種供試水稻的Asat和Gs 變化達到顯著水平（P<0.01）。相對于CF 處理，汕優(yōu) 63 在 O3?2 處理下的Asat和 Gs 分別顯著下降 44.3%和 55.2%，兩個水稻品種的Asat和 Gs 值均為 O3?1 處理大于O3?2處理。而不同時期O3熏蒸對兩種供試水稻的Ci值無顯著影響（圖2）。

在不同生育期進行O3熏蒸顯著降低了兩種供試水稻的F′v/F′m 與PhiPS2 值（P<0.01），qP 變化不顯著。相對于 CF 處理，汕優(yōu) 63 和武育粳 3 號在 O3?2 處理下的F′v/F′m 值分別顯著下降10.9%和11.0%，武育粳 3 號 O3?2 處理下的 PhiPS2 值比 CF 處理顯著低25.8%（圖3）。

由圖4 可見，不同生育期O3熏蒸處理下，兩種供試水稻的Vcmax和Jmax的降幅均達到顯著水平（P<0.01和P<0.05）。其中，汕優(yōu) 63 和武育粳 3 號在 O3?2 處理下的Vcmax值比CF 處理分別低48.2%和38.2%，O3?2處理下的汕優(yōu)63的Jmax值較CF 處理低51.8%，差異達到顯著水平。Ls 與Ci 變化趨勢相反。兩種水稻的Vcmax/Jmax值均表現(xiàn)為 O3?1>O3?2。不同品種及處理與品種的交互作用對光合特性的影響均未達到統(tǒng)計學顯著。

2.3 不同生育期臭氧熏蒸對水稻葉片光合色素含量的影響

不同時期O3熏蒸處理下兩種水稻的Chl a、Chl b和Chl a+b 的變化一致，雖未達到顯著水平，但O3?2處理降幅大于O3?1 處理，兩個水稻品種的Chl b 含量差異達到顯著水平（P<0.01）。對于Car，汕優(yōu)63 表現(xiàn)為 O3?1 處理大于 O3?2 處理，而武育粳 3 號則相反。不同O3處理和處理與品種的交互作用均未達到顯著水平（圖5）。

2.4 不同生育期臭氧熏蒸對水稻葉片氮含量的影響

不同生育期O3熏蒸處理下水稻的Narea的變化達到顯著水平（P<0.05），同時兩個水稻品種的Narea差異顯著（P<0.05），Nmass變化不顯著，兩種水稻品種的Nmass和Narea含量均表現(xiàn)為O3?1>CF>O3?2，但未出現(xiàn)顯著的O3處理與品種交互作用（圖6）。

3 討論

光合作用是綠色植物積累有機物的最重要方式，并最終決定植物生物量。葉綠素熒光是光合作用光反應的重要指標，也是了解逆境下生長的植物光化學和非光化學現(xiàn)象的重要工具[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，與CF相比，汕優(yōu) 63 的Asat值和武育粳 3 號的 PhiPS2 值在O3?2處理下顯著降低，同時兩個水稻品種的F′v/F′m的平均值也顯著降低，這表明O3對兩個水稻品種不同生育期光合作用的影響存在差異，在抽穗灌漿期影響更大。已有的研究表明，O3能加劇葉綠體膜系統(tǒng)的膜脂過氧化作用，使水稻的膜系統(tǒng)遭到損害，進一步導致葉綠素降解，葉綠素含量下降，最終使得葉片加速衰老。葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，通常被認為是影響光合作用的重要因素之一[29]。與光合參數(shù)一致，不同生育期O3熏蒸導致葉綠素含量下降，O3?2處理降幅大于O3?1處理，表明水稻抽穗灌漿期對O3響應更大。這與前人對其他作物的研究結(jié)論一致，即O3對作物的灌漿期影響較大[30]。PLEIJEL等[31]在春小麥的不同生育期進行相同劑量的O3熏蒸試驗，發(fā)現(xiàn)在開花期至成熟期進行O3熏蒸引起的產(chǎn)量損失達到11%，而開花期前熏蒸產(chǎn)量損失僅為2%，證實O3對小麥開花期至成熟期影響更大。此外，在對豆類[32]作物的研究中也有相似結(jié)論，開花后O3暴露對豆莢產(chǎn)量的影響比開花前更大。

在田間試驗中，Asat往往受到氣孔和非氣孔兩個因素共同限制，有研究表明O3引起的Asat降低主要原因是非氣孔因素[33]。葉片內(nèi)Rubisco 的活性Vcmax以及RuBP 再生的最大速率Jmax都能夠反映限制植物光合的非氣孔因素[34]。FENG 等[35]和 LI 等[36]對小麥和木本植物進行了整合分析，結(jié)果表明，平均O3濃度為73 nmol·mol?1時小麥Vcmax降低 18%，平均 O3濃度為 71 nmol·mol?1時 我國木本植物Vcmax和Jmax分別降低 了19%和20%。FENG 等[17]利用FACE 平臺探究O3對5個不同冬小麥品種光合作用影響的差異，結(jié)果表明O3對不同小麥品種影響的差異主要歸因于非氣孔因素（如抗氧化酶）而不是Gs。在本研究中，O3對兩個水稻品種的影響也更多是由非氣孔因素限制。相對于 CF，O3?2 處理導致汕優(yōu) 63 的 Gs 和Jmax的降幅均達到顯著水平，兩種水稻品種在O3?2 處理下的Vcmax平均值較CF 處理顯著降低43.2%，Ls 變化不顯著。光合、熒光及Vcmax和Jmax參數(shù)表明O3對水稻抽穗灌漿期影響更大。

LMA 是衡量植物對O3敏感性的重要指標，已有大量研究表明O3能顯著降低木本植物葉片的LMA[37]，LMA 值越大，植物對 O3敏感性越低[38]。在本文研究中，不同時期O3熏蒸導致兩個水稻品種的LMA 降低，但降幅未達到顯著，這與PENG 等[39]對玉米的研究結(jié)果一致，可能與O3熏蒸時間較短或水稻抗性較強有關(guān)。兩個水稻品種在O3?1處理下的LMA更高，這表明分蘗拔節(jié)期處理下的水稻O3敏感性更低，抗性更高。葉片氮主要存在于蛋白質(zhì)、核酸和葉綠體中，對植物光合作用起關(guān)鍵作用，其濃度與光合速率、電子傳遞速率、羧化速率及葉片抗氧化能力密切相關(guān)。已有的研究表明O3濃度升高不僅增加Nmass、降低Narea，還改變了氮在葉片不同功能上的分配[40]。而在本研究中，O3?1 處理下的Nmass和Narea值相對 CF處理有所增加，而O3?2 處理下則相對減少，這說明在抽穗灌漿期進行O3熏蒸會使葉片的抗氧化能力減弱，抗氧化系統(tǒng)對ROS 的解毒和修復功能減弱，導致ROS累積，使植物的光合作用和生理代謝機能受到限制。LMA 與葉片氮含量的變化證實O3對兩個水稻品種生長在抽穗灌漿期影響更大。

已有的研究表明[24]，O3導致汕優(yōu) 63 比武育粳 3 號的Asat和葉綠素含量下降時間更早、幅度更大，結(jié)合產(chǎn)量數(shù)據(jù)，認為在整個生育期進行O3熏蒸時，汕優(yōu)63比武育粳3號更敏感。本研究發(fā)現(xiàn)，不同生育期O3熏蒸導致兩個水稻品種的光合與生長指標降幅接近，表明在不同生育期進行O3熏蒸，兩個水稻品種對O3的敏感性是相似的。此外，兩個水稻品種僅在株高、Chl b和Narea值方面存在顯著差異，而其他光合指標品種間無顯著差異，并且水稻的生長及光合參數(shù)均未表現(xiàn)出顯著的品種與O3處理的交互作用，表明本試驗中汕優(yōu)63 與武育粳3 號在應對不同生育期O3熏蒸時的響應相似。

本試驗結(jié)果表明不同生育期O3熏蒸對兩個水稻品種的光合作用及生長的影響存在顯著性差異，水稻抽穗灌漿期對O3響應更強，但兩個水稻品種應對不同生育期O3熏蒸時的響應是相似的。本試驗在OTC內(nèi)進行，與外界自然環(huán)境存在一定差距，而且盆栽試驗易受到在氣室中所處位置的影響及根系限制。因此，可進一步在大田試驗中利用O3?FACE 平臺，在水稻生長的不同生育期開展O3熏蒸試驗，驗證本試驗結(jié)論，為水稻生長的不同生育期對O3脅迫敏感度提供可靠依據(jù)。本試驗結(jié)果有利于更加準確且有針對性地采取防治措施，如采取水肥一體化管理措施或外源噴施O3防護劑等，對水稻生長的關(guān)鍵生育期進行精準的防護，從而有效減緩O3造成的水稻減產(chǎn)。

4 結(jié)論

（1）O3對兩個水稻品種的不同生育期影響不同，對抽穗灌漿期光合作用及生長的影響更大。

（2）雜交稻汕優(yōu)63 和粳稻武育粳3 號對O3的響應相似。