房一明 李瑞 賀書珍 朱自慧 趙溪竹

摘? 要：本研究采用高效液相色譜、酶標(biāo)檢測技術(shù)，確定可可豆加工過程中黃烷醇類物質(zhì)組成變化趨勢，分析抗氧化活性。在發(fā)酵及焙炒階段檢測黃烷醇物質(zhì)兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、原花青素B1（PC B1）、原花青素B2（PC B2）。結(jié)果表明：經(jīng)7 d發(fā)酵各成分含量分別為EGC（8.521～ 3.017 mg/g）、C（15.521～6.633 mg/g）、EC（19.615～3.142 mg/g）、ECG（0.236～0.084 mg/g）、PC B1（19.152～10.774 mg/g）、PC B2（4.254～2.083 mg/g），發(fā)酵使得可可豆中兒茶素及低聚物含量大量減少;135 ℃不同時間焙炒下，各物質(zhì)含量分別為EGC（3.079～2.221 mg/g）、C（8.611～5.143 mg/g）、EC（3.956～0.982 mg/g）、ECG（0.111～0.070 mg/g）、PC B1（10.987～ 8.223 mg/g）、PC B2（2.385～1.534 mg/g）?？煽啥乖诟邷乇撼磿r，DPPH、ABTS自由基清除率呈下降趨勢，降低了可可抗氧化活性。研究結(jié)果為可可加工提供相關(guān)保健功能性的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：可可;發(fā)酵和焙烤;黃烷醇物質(zhì)組成;抗氧化活性

中圖分類號：TS274????? 文獻標(biāo)識碼：A

Analysis of Flavanol Compounds Changes and Antioxidant Activity of Cocoa Bean During Processing

FANG Yiming1，2，3，4， LI Rui1，2，3，4， HE Shuzhen1，2，3，4， ZHU Zihui1，2，3，4， ZHAO Xizhu1，2，3，4*

1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Science， Wanning， Hainan 571533， China; 2. National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research， Wanning， Hainan 571533， China; 3. Key Laboratory of Processing Suitability and Quality Control of the Special Tropical Crops of Hainan Province， Wanning， Hainan 571533， China; 4. Hainan Provincial Engineering Research Center of Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract： In this study， high-performance liquid chromatography and enzyme-labeled detection technology were used to determine the changing trend of flavanols and analyze the antioxidant activity during the processing of cocoa beans. The content of catechin （C）， epicatechin （EC）， epigallocatechin （EGC）， epicatechin gallate （ECG）， proanthocyanidin B1 （PC B1）， proanthocyanidin B2 （PC B2） during fermentation and roasting were assayed. The content of for EGC， C， EC， ECG， PC B1， PC B2 was 8.521?3.017 mg/g， 15.521?6.633 mg/g， 19.615?3.142 mg/g， 0.236?0.084 mg/g， 19.152?10.774 mg/g， 4.254?2.083 mg/g， respectively during 7 days fermentation. The content of catechins and oligomers greatly reduced in cocoa beans during fermentation. The content of EGC， C， EC， ECG， PC B1， PC B2 was 3.079?2.221 mg/g， 8.611? 5.143 mg/g， 3.956?0.982 mg/g， 0.111?0.070 mg/g， 10.987?8.223 mg/g， 2.385?1.534 mg/g， correspondingly roasted at 135 ℃ for different times. The clearance rates of DPPH and ABTS+? showed a downward trend during high-temperature roasting of cocoa beans. The antioxidant activity has reduced of cocoa bean. This would provide a theoretical basis for related health care functionality on cocoa processing.

Keywords： cocoa bean; fermentation and roasting; flavanol composition; antioxidant activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.035

可可種子富含油酸、亞油酸、硬脂酸、有機物、礦物質(zhì)、多聚體單寧、可可堿、黃酮類化合物、膳食纖維等活性成分，研究表明可可具有控制食欲、美膚美容、降脂護心、清口固齒、抗氧化益壽等功效[1]，可可制品有“世界零食之王”的美譽，是制作高級飲品、巧克力、糖果、糕點和冰淇淋的主要原料[2-3]。

可可富含多酚，包括低聚體類黃酮物質(zhì)，其中主要有黃烷醇低聚體–原花青素和單體兒茶素，黃烷醇在可可豆中的含量較其他大多數(shù)食物高。主要以EC和C兩種單體形式存在，這些單體通過C4和C8鍵的連接可形成聚合體，這些聚合物稱之為原花青素，常見的原花青素以EC聚合為主[4-5]。黃烷醇類化合物是一類廣泛存在于天然植物中的多元酚化合物，其中兒茶素（C）和培兒茶素（GC）是具有代表性的黃烷醇類化合物。Kongor等[6]研究發(fā)現(xiàn)多酚在發(fā)酵和干燥過程中也被多酚氧化酶氧化，從而降低了豆的澀味和苦味，增強了可可豆的風(fēng)味。湯雯[7]建立了可可多酚總酚含量和各類多酚的檢測方法，表明PC類物質(zhì)具有很高的抗氧化活性，可可多酚具有清除自由基能力。谷風(fēng)林等[8]通過正交試驗確定可可豆中多酚類物質(zhì)的最優(yōu)萃取條件，并對不同提取條件下的可可多酚類化合物進行定量分析，發(fā)現(xiàn)其中兒茶素含量最多。易橋賓等[9]采用HPLC方法檢測，發(fā)現(xiàn)在105～145 ℃的溫度焙烤下可可中沒食子酸含量變化明顯。

目前對于可可豆在發(fā)酵與焙烤過程中黃烷醇類物質(zhì)組分的變化趨勢及抗氧化能力變化趨勢分析尚不完全，因此對可可加工中黃烷醇類物質(zhì)組分演變規(guī)律、抗氧化能力變化趨勢分析的研究尤為重要，需要對其進行深入系統(tǒng)分析。該研究對可可生產(chǎn)措施、質(zhì)量控制具有借鑒和指導(dǎo)意義，可對可可加工提供相關(guān)保健功能性的依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 可可鮮果，品種為‘熱引4號，采摘于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所內(nèi)，采摘時生長期為5個月，果皮為黃色、淡紅色的成熟鮮果。

兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、原花青素（B1）、原花青素（B2）、Trolox標(biāo)準(zhǔn)品（以上均為標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，購于維克奇公司）;DPPH（純度≥98%，購于阿拉丁）、ABTS（純度≥98%，購于美國西格瑪）;乙腈（色譜級，購于美國Fisher公司），乙酸、甲醇、無水乙醇、過硫酸鉀、磷酸、30～60 ℃沸程石油醚，均為分析純。

1.1.2? 儀器與設(shè)備? CBR-101烘焙機，韓國Gene Café;AL104分析天平，美國Mettler-Toledo;SHZ-C水浴恒溫振蕩器，上海博迅;CT18RT高速離心機，上海天美;Master-s-plus UVF全自動超純水機，中國和泰;Specord 250 Plus紫外可見分光光度儀，德國耶拿;1260高效液相色譜儀，美國安捷倫;MA112快速水分測定儀，美國METTLER TOLEDO;SynergyH1酶標(biāo)儀，美國BioTek;SB-5200DT超聲波清洗儀，寧波新芝。

1.2? 方法

1.2.1? 材料制備? 可可果實成熟后采收下來，手工剖開果殼，取出可可鮮豆?？煽蓾穸沟谷肽鞠渲校鞠渌闹苡锌p隙，底部有孔，以便于可可發(fā)酵液流出，頂部蓋好箱蓋，每天定時翻動1次，連續(xù)7 d，并取箱子中部可可豆樣品1 kg（樣品依次標(biāo)記為 F0、F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7），將樣品可可濕豆清洗脫膠，40 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥，密封備用。取發(fā)酵完成的可可豆焙烤，不同焙烤時間條件：溫度設(shè)定為135 ℃分別焙烤 0、5、10、15、20、25、30、35 min，焙烤樣品標(biāo)記為T-0、T-5、T-10、T-15、T-20、T-25、T-30、T-35。為了確定可可豆中的黃烷醇在焙烤過程中的組成成分變化，每個焙烤時間下的樣品進行獨立取樣?？煽啥菇?jīng)焙烤、去皮、研磨，過60目篩密封避光保存待用。準(zhǔn)確稱取可可粉加入30～60 ℃沸程的石油醚，料液比為1∶25，索氏抽提脫脂10～12 h，脫脂可可粉于30 ℃下避光烘干，4 ℃密封避光貯藏備用。水分測定采用快速水分測定儀測定（以干基計）。

1.2.2? 樣品的提取? 準(zhǔn)確稱取1 g脫脂樣品于10 mL離心管中，加入5 mL 70%甲醇提取液，2000 r/min渦旋5 min后置于20 ℃水浴超聲30 min，離心管取出后放于4 ℃的離心機中，以8000 r/min的轉(zhuǎn)速，運行15 min。取上層提取液用0.22 μm過濾膜過濾，待測樣品4 ℃條件下避光保存?zhèn)溆肹10-11]。

1.2.3? 黃烷醇類物質(zhì)兒茶素單體標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品檢測? 準(zhǔn)確稱取C、EC、ECG、EGC、EGCG 5種標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用70%甲醇溶液溶解定容至10 mL，得到1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩Ｅ渲茲舛确謩e為25、50、100、200、300、400、500 μg/mL工作液，經(jīng)0.22 μm過濾膜過濾，待測。色譜柱：Agilent C18（4.6 mm× 150 mm，3.5 ?m），用100%乙腈溶液A和0.1%乙酸水溶液B做流動相，檢測方法：0～8 min，45%～60% A;8～10 min，60%～20% A。檢測波長為280 nm，進樣體積為10 ?L，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃[7， 12-13]。

1.2.4? 黃烷醇類物質(zhì)原花青素低聚物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品檢測? 準(zhǔn)確稱取PC B1、PC B2 2種標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用70%甲醇溶液溶解定容至10 mL，得到1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩Ｅ渲茲舛确謩e為25、50、100、200、300、400、500 μg/mL工作液，經(jīng)0.22 μm過濾膜過濾，待測。色譜柱：Agilent C18（4.6 mm× 150 mm，3.5 ?m），用100%乙腈溶液A和0.1%乙酸水溶液B做流動相，分析方法：0～15 min，15%～40% A;15～20 min，40%～20% A。檢測波長為280 nm，進樣體積為10 ?L，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃[13]。

1.2.5? 可可豆加工過程中抗氧化活性變化趨勢研究? 樣品提取：準(zhǔn)確稱取1 g脫脂可可粉于50 mL離心管中，加入20 mL 90%乙醇提取液，2000 r/min渦旋5 min后置于50 ℃水浴超聲60 min，4000 r/min離心10 min，收集上清液，殘渣再在相同條件下提取2次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用90%甲醇定容至25 mL，4 ℃冰箱中避光保存待測[14-15]。

（1）DPPH自由基清除能力測定。稱取DPPH粉末0.0039 g，用無水乙醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶，即配制成0.2 mmol/L DPPH溶液，4 ℃冰箱中避光保存。分別取2.0 mL不同濃度的待測樣品溶液，加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm下測定吸光度值A(chǔ)i。以等體積無水乙醇溶液代替DPPH溶液測定吸光度值A(chǔ)t，用等體積的無水乙醇溶液代替樣品溶液測定吸光度值A(chǔ)0，實驗設(shè)置3次重復(fù)，以Trolox作為陽性對照[16-18]。根據(jù)公式計算DPPH自由基清除率：

（2）ABTS自由基清除能力測定。采用酶標(biāo)儀法，稱取0.0384 g ABTS，蒸餾水定容至10 mL，得濃度為7 mmol/L ABTS水溶液，稱取0.0066 g過硫酸鉀，蒸餾水定容至10 mL，得2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液。將以上兩種現(xiàn)配溶液按1∶1（V/V）混合，在室溫下黑暗中放置12～16 h，以生成ABTS+·（ABTS溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）[19]。ABTS+·溶液用無水乙醇稀釋，直到其在734 nm的吸光度為0.7±0.02。取3.9 mL稀釋后的ABTS+·溶液，加入100 μL不同濃度的待測樣品溶液濃度并渦旋混合。室溫下避光反應(yīng)10 min， 734 nm處檢測其吸收峰。以不同質(zhì)量濃度Trolox（6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/mL）為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表示為每克干物質(zhì)的Trolox當(dāng)量（mg/g）[20]。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2017軟件作圖，用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 可可豆加工過程中黃烷醇類物質(zhì)組成及含量分析

2.1.1? 6 種標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線和色譜圖? 在0.025～ 0.5 mg/mL 含量范圍與所測峰面積的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，線性關(guān)系良好，因此可用各標(biāo)準(zhǔn)曲線對可可樣品中的各單體兒茶素及低聚物原花青素進行定量，結(jié)果如表1。

由圖1 HPLC色譜圖可以推測，黃烷醇4種單體分別為C、EC、EGC、ECG，2種原花青素單體為PC B1、PC B2，在發(fā)酵及焙炒階段都可以檢測到這6中化合物。

2.1.2? 發(fā)酵階段可可豆黃烷醇單體及低聚物變化趨勢? 由圖2可知，發(fā)酵可可豆各物質(zhì)含量分別為EGC（8.521～3.017 mg/g）、C（15.521～ 6.633 mg/g）、EC（19.615～3.142 mg/g）、ECG（0.236～0.084 mg/g）、PC B1（19.152～10.774 mg/g）、PC B2（4.254～ 2.083 mg/g），發(fā)酵使得可可豆中黃烷醇單體兒茶素及原花青素低聚物含量大量減少，在初始發(fā)酵階段，各組成物質(zhì)含量下降較快。本研究所測含量低于湯雯[7]所測定范圍，結(jié)果有差異可能與可可豆品種、發(fā)酵方式、發(fā)酵程度有關(guān);C降解趨勢比EC略微平緩，C經(jīng)氧化、水解、聚合和轉(zhuǎn)化后，含量降低[21];EGC降解趨勢緩慢，ECG少量存在可可豆中，含量變化小，趨勢不明顯。后發(fā)酵階段含量變化逐漸穩(wěn)定，各物質(zhì)受外界影響因素較小;PC B1含量極高，降解速度比PC B2快。

2.1.3? 焙炒階段可可豆黃烷醇單體及低聚物變化趨勢? 由圖3可知，經(jīng)135 ℃在不同時間下焙烤可可豆，各化合物含量分別為EGC（3.079～ 2.221 mg/g）、C（8.611～5.143 mg/g）、EC（3.956～ 0.982 mg/g）、ECG（0.111～0.070 mg/g）、PC B1（10.987～8.223 mg/g）、PC B2（2.385～ 1.534 mg/g），6種化合物的初始含量在初始階段有所增加，可能短時間焙炒使一些物質(zhì)發(fā)生氧化，處于中間氧化態(tài)的酚類化合物使其含量升高，之后由于大量熱空氣進入，物質(zhì)被完全氧化，轉(zhuǎn)變成其他物質(zhì)，導(dǎo)致含量降低。其中EC逐漸降解，在各化合物中降解速度較快，受溫度和時間影響，EC的降解也可能是在焙燒條件下發(fā)生的脫脂反應(yīng)的結(jié)果[22]。C降解速度略為緩慢，焙炒過程中C的升高可能是由于EC轉(zhuǎn)化的結(jié)果，C濃度較高的原因還在于原花青素降解為游離黃酮-3-醇單體，如兒茶素和表兒茶素[10]。EC、EGC在前10 min內(nèi)已經(jīng)發(fā)生降解，可可豆焙燒過程中PC B1、PC B2緩慢降解。由此可知時間對黃烷醇兒茶素單體及原花青素低聚物影響較小。

2.2? 可可豆加工過程中抗氧化活性變化趨勢分析

2.2.1? DPPH自由基清除能力測定? DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有較強吸收峰，當(dāng)清除劑存在時，孤對電子被配對，吸收消失或減弱，通過測定吸收減弱程度，可評價自由基清除劑的活性。半數(shù)抑制濃度（IC50）是衡量DPPH·法測定結(jié)果的指標(biāo)，指造成50% DPPH活性損失的濃度[7]。本文采用清除DPPH·自由基體外抗氧化模型，研究可可豆發(fā)酵及焙炒階段抗氧化活性變化趨勢，結(jié)果見圖4。

由圖4A可知，在可可豆焙炒階段，相同樣品濃度下，在0～5 min抗氧化能力增強，之后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢;在不同焙炒階段，如圖4B所示，以Trolox作為陽性對照，分別計算各樣品的IC50值為152.931、146.809、186.893、286.361、311.606、318.893、325.159、354.355 μg/mL，對照品Trolox半抑制濃度最低，其次是焙炒5 min低于原料豆，之后所需量依次遞增，即DPPH自由基清除能力總體上隨焙烤時間增加，可可DPPH清除自由基能力逐漸下降。熱處理過程中產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，使細胞基質(zhì)釋放結(jié)合的酚類化合物形成新的抗氧化劑，使自由基清除活性增加[23]，即在焙炒0～5 min這一階段DPPH清除能力增加。由圖可看出，在15～35 min內(nèi)，可可清除DPPH自由基變化不明顯，易橋賓等[9]在20～40 min焙烤時間內(nèi)，時間因素對多酚含量的影響有限，引起的含量變化較小，結(jié)果一致。

2.2.2? ABTS自由基清除能力測定? ABTS+·經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS+·，向其中加入待測物質(zhì)，若樣品中存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會與ABTS+·發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，在最大吸收波長下（一般選擇734 nm）檢測吸光度的變化，與Trolox對照品比較，換算出被測物質(zhì)總的抗氧化能力，結(jié)果表示為每g測試物質(zhì)相當(dāng)?shù)目寡趸芰λ枰腡rolox的微摩爾數(shù)[7]。本論文采用清除ABTS+·自由基體外抗氧化模型，研究可可豆發(fā)酵及焙炒階段抗氧化活性變化趨勢，結(jié)果見圖5。

由圖5A可知，在可可豆焙炒階段，相同樣品濃度下，在0～15 min ABTS+·清除率有上升趨勢，隨著焙炒時間的延長可可豆ABTS+·清除率總體呈緩慢下降趨勢，其變化趨勢總體上與DPPH清除能力相似。如圖5B所示，以Trolox作為陽的IC50值，0～35 min分別為0 min（39.986 mol/g）、5 min（47.375 mol/g）、10 min（45.600 mol/g），15 min（41.115 mol/g）、20 min（30.459 mol/g）、25 min（23.720 mol/g）、30 min（16.996 mol/g），35 min（15.491 mol/g），對照品Trolox半抑制濃度最低，焙炒階段可可ABTS+·清除率總體呈下降趨勢。在熱處理后，ABTS+·自由基清除活性隨著焙燒溫度從120 ℃升高至150 ℃而逐漸降低[16]。80 ℃下預(yù)烘烤10 min和130～160 ℃下烘焙15 min，可可提取物對水溶性穩(wěn)定性具有較低的清除活性[24]。本研究結(jié)果與之一致。

3? 討論

黃烷醇是可可多酚的主要成分，多酚是有益健康特性的抗氧化劑，可可中的多酚不僅賦予可可澀味和苦味，還賦予其卓越的抗氧化活性?？煽傻陌l(fā)酵導(dǎo)致可溶性多酚的大量減少，黃烷醇含量降低可能會導(dǎo)致豆類的抗氧化能力下降。在發(fā)酵過程中，由于水分的釋放，多酚化合物的進一步氧化和縮合，豆中的多酚濃度降低[25]。同時，伴隨溫度升高的焙炒處理顯著降低了包括原花青素在內(nèi)的多酚含量[26]。

可可黃烷醇中檢測到4種單體分別為C、EC、ECG、EGC，原花青素低聚物為PC B1、PC B2，可可中C、EC、EGC、PC B1含量相對較高。在發(fā)酵階段，黃烷醇單體及低聚物含量減少，其中EC、PC B1減少趨勢明顯，經(jīng)7 d發(fā)酵使得可可豆中兒茶素及低聚物含量大量減少，ECG、PC B2含量低，在這一階段變化不明顯。黃烷醇變化是由O-C鍵斷裂后C環(huán)的打開/閉合引發(fā)的熱異構(gòu)化過程引起的立體化學(xué)結(jié)果。（-）（2R，3R）表兒茶素可以通過此加熱過程轉(zhuǎn)化為（2S，3R）（-）兒茶素，而（+）（2R，3S）兒茶素可以轉(zhuǎn)化為（2S，3S）（+）表兒茶素[26]。經(jīng)135 ℃在不同焙炒時間下，單體及低聚物在初始階段含量短暫升高，可能與焙炒時物質(zhì)發(fā)生氧化有關(guān)，處于中間氧化態(tài)的化合物使其含量升高。在10 min內(nèi)發(fā)生顯著降解，EC降解快，C速度平緩。DPPH與ABTS測得焙炒階段可可提取物抗氧化活性，DPPH清除自由基能力強于ABTS。5 min內(nèi)出現(xiàn)抗氧化能力提升現(xiàn)象，之后開始降低，這可能與多酚受高溫發(fā)生美拉德反應(yīng)有關(guān)，時間對抗氧化能力影響小，下降趨勢平緩。135 ℃不同時間焙炒下C（8.611～5.143 mg/g）和PC B1（10.987～8.223 mg/g）的含量仍較高?？煽啥乖诟邷乇撼磿r，DPPH，ABTS+?清除率呈下降趨勢，降低了可可抗氧化活性，結(jié)果與Gültekin- ?zgüven等[27]研究一致。可可豆需通過發(fā)酵、焙炒才可促進其巧克力風(fēng)味的形成，經(jīng)發(fā)酵加工可可抗氧化能力雖然降低，但相較于其他原料，加工后的可可豆仍然含有較高含量的抗氧化活性物質(zhì)，仍是一個很好的抗氧化化合物來源。此結(jié)果為可可加工提供相關(guān)保健功能性的理論依據(jù)。

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責(zé)任編輯：崔麗虹