王藝瑋 馮仁軍 黃亞成 劉曉東 方永軍 羅紅麗 唐朝榮

摘? 要：天然橡膠是重要的工業(yè)原材料，主要來自橡膠樹樹皮中的乳管。乙烯能促進橡膠樹乳管產(chǎn)膠和排膠，在樹皮上施用乙烯利（一種乙烯釋放劑）或乙烯可顯著提高膠乳產(chǎn)量?；诒菊n題組前期獲得的橡膠樹基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆橡膠樹中乙烯合成通路關(guān)鍵酶——1-氨基環(huán)丙烷基-1-羧酸（ACC）氧化酶基因家族（HbACOs）的全部8個家族基因，研究其組織表達模式。結(jié)果表明：在分析的7種組織中，盡管HbACO基因存在不同程度的冗余表達，但每種基因的組織表達模式具有明顯的特異性，其中HbACO7是樹皮中表達量最高的家族基因。HbACO7基因的表達在割膠季節(jié)的不同月份發(fā)生明顯變化，其中在8月的表達量最高。成功構(gòu)建了HbACO7基因的原核表達載體，實現(xiàn)其在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達。純化后的HbACO7重組蛋白具有明顯的ACO酶催化活性，成功地催化了乙烯的體外合成。該結(jié)果將為后續(xù)橡膠樹樹皮中的乙烯生物合成調(diào)控機制研究提供參考。

關(guān)鍵詞：橡膠樹;乙烯;生物合成;HbACO7;酶活

中圖分類號：S794.1????? 文獻標(biāo)識碼：A

Expression and Function of an ACC Oxidase Gene （HbACO7） from the Bark of Hevea brasiliensis

WANG Yiwei1， FENG Renjun1，2， HUANG Yacheng1， LIU Xiaodong1， FANG Yongjun3， LUO Hongli1， TANG Chaorong

1. Natural Rubber Cooperative Innovation Center， Hainan Province & Ministry of Education of PRC / College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Hainan Key Laboratory of Tropical Brain Research and Transformation， Hainan Medical College， Haikou， Hainan 571199， China; 3. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Natural rubber is an important industrial raw material， mainly harvested from the rubber-producing laticifers residing in the bark of rubber tree （Hevea brasiliensis）. Previous studies reveal that ethylene promotes both latex flow and regeneration， and the application of ethrel （an ethylene generator） or ethylene on bark could stimulate latex yield. In this study， based on the Hevea genome and transcriptome database we previously constructed， eight HbACO genes encoding the Hevea ACC oxidase （ACO）， a key enzyme in ethylene biosynthesis， were cloned and examined for their expression patterns in seven Hevea tissues. Although the HbACO genes exhibited varying degrees of redundant expression in the seven tissues examined， each retained a distinct pattern of tissue expression. Of the eight HbACOs， HbACO7 showed the highest expression in the bark. The expressions of HbACO7 fluctuated greatly with the change of tapping months， showing the highest level in August. The prokaryotic expression vector HbACO7 was successfully constructed， and the expression of HbACO7 protein was induced in E. coli BL21. The purified HbACO7 recombinant protein successfully catalyzed ethylene synthesis in vitro， indicating its functionality as an active ACO enzyme. This study would lay a foundation for further research on the regulatory mechanism of ethylene biosynthesis in the bark of rubber tree.

Keywords： Hevea brasiliensis; ethylene; biosynthesis; HbACO7; enzyme activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.001

橡膠樹[Hevea brasiliensis （Willd. ex A. Juss.） Muell. Arg]，又稱三葉橡膠樹或巴西橡膠樹，大戟科橡膠樹屬落葉喬木，原產(chǎn)于亞馬遜河流域。中國植膠區(qū)主要分布于海南、云南和廣東地區(qū)。由于橡膠樹合成的天然橡膠綜合性能優(yōu)異，迄今無法被人工合成橡膠完全替代，是重要的戰(zhàn)略物資和工業(yè)原料[1-3]。在天然橡膠的生產(chǎn)過程中，長期使用乙烯作為膠乳增產(chǎn)刺激劑[4]。雖然關(guān)于外源乙烯刺激橡膠樹膠乳增產(chǎn)的研究較多[5-9]，但對于橡膠樹樹皮內(nèi)源乙烯生物合成通路中1-氨基環(huán)丙烷基-1-羧酸（ACC）氧化酶（ACO）基因的研究卻很少，尚未見關(guān)于橡膠樹ACO酶活方面的研究報道。

乙烯生物合成途徑的調(diào)控較為復(fù)雜，涉及很多因素[7]，其中ACO基因家族包含了眾多成員，受一定的外界和內(nèi)在因素影響，從而改變基因表達、蛋白量與酶活性，最終調(diào)控乙烯的產(chǎn)生[10-11]。ACO氧化ACC生成乙烯是乙烯合成途徑的最后一步[12]，近年來許多研究顯示，在很多植物生理活動中ACO基因的表達能夠被快速地誘導(dǎo)，表明ACO可能是調(diào)控乙烯生物合成的一個關(guān)鍵酶[5-6]。在橡膠樹中，研究發(fā)現(xiàn)在樹皮上施用外源乙烯或通過割膠、機械傷害等在樹皮中產(chǎn)生的內(nèi)源乙烯均可刺激膠乳產(chǎn)量[13-14];本課題組前期基于轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹乳管中的內(nèi)源乙烯的合成能力很弱，但卻存在活躍的乙烯信號傳遞與應(yīng)答通路，從源頭上回答了外源乙烯顯著刺激膠乳產(chǎn)量的機制[15]?；谝陨闲畔?，推測橡膠樹樹皮中的ACO酶可能通過調(diào)控樹皮中的乙烯生物合成影響橡膠樹的產(chǎn)排膠。鑒于此，本研究擬克隆橡膠樹樹皮中乙烯生物合成關(guān)鍵酶ACO基因（HbACO），并對其進行組織表達特性、不同割膠月份表達、原核表達及酶活性分析，為今后深入研究橡膠樹ACO基因的表達調(diào)控與產(chǎn)膠關(guān)系提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 采樣地? 采樣地點位于海南省澄邁縣的紅星農(nóng)場（19.837°N，110.016°E）。該采樣點位于海南島的北部，屬熱帶海洋性季風(fēng)氣候。降水主要集中在5—10月，其中8月臺風(fēng)季時降水量及相對濕度達到峰值，而11—12月幾乎無降雨;5—10月的平均溫度浮動不大，維持在30 ℃左右，11月開始下降，12月最低，可低至15 ℃以下。

1.1.2? 植物材料? 巴西橡膠樹品種為‘熱研7-33-97，樹齡9 a，第2年割膠，選取5株長勢和樹圍基本一致的橡膠樹，分別于2019年5月24日、6月27日、8月6日、8月27日、9月25日、10月25日、11月23日和12月25日上午6：00割膠，進行不同季節(jié)的橡膠樹樹皮樣品采集。采樣前，撕去割膠口上附著的膠線，切割樹皮后立即裝入50 mL無RNA酶的離心管中，蓋緊瓶蓋，液氮中保存待用。記錄每次采樣時的天氣數(shù)據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)采樣期間的降水量和溫度變化情況。

1.1.3? 質(zhì)粒及菌株? 原核表達載體pNC-ET28購自海南壹田生物科技有限公司;pEASY?-Blunt克隆載體、Trans1-T1感受態(tài)細胞及BL21感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pET28a質(zhì)粒為本實驗室保存。

1.1.4? 試劑? ACC購自Sigma公司;通用植物總RNA大量提取試劑盒（離心柱型）購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;通用型DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;TransStart? FastPfu DNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit購自TaKaRa公司;Nimble Cloning原核表達系統(tǒng)試劑盒購自海南壹田生物科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司;FastStart Essential DNA Green Master試劑盒購自Roche公司;鎳離子螯合磁珠購自海貍納米科技（蘇州）有限公司;其他常規(guī)試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 橡膠樹樹皮總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄? 根據(jù)通用植物總RNA大量提取試劑盒（離心柱型）說明書，提取不同季節(jié)采集的橡膠樹樹皮總RNA，經(jīng)電泳檢測條帶完整無降解后，于–80 ℃保存?zhèn)溆谩＠梅崔D(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并置于–80 ℃保存待用。

1.2.2? HbACOs家族基因克隆? 利用生物信息學(xué)工具，從本課題組報道的基因組數(shù)據(jù)中篩選到8個HbACOs基因[15];用本地Blast工具搜索巴西橡膠樹‘熱研7-33-97轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫得到了基因的全長CDS序列，將其分別命名為HbACO1～ HbACO8（表1）;利用Premier 5.0軟件，設(shè)計上述基因的特異性擴增引物（表2），委托北京六合華大基因科技有限公司合成。

參照相關(guān)文獻[16-18]，以橡膠樹樹皮的cDNA為模板，對8個HbACO基因進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠檢測后，使用通用型DNA純化回收試劑盒回收目標(biāo)片段;將回收產(chǎn)物連接至Blunt克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞后涂于含有卡那霉素（100 mg/mL）的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜后，挑取菌落進行PCR檢測;將PCR檢測呈陽性的菌落進行菌液培養(yǎng)，送華大基因公司進行測序鑒定。根據(jù)測序鑒定后的HbACOs基因在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[15]中表達量的高低，篩選出樹皮中表達量最高的HbACO基因。

1.2.3? qRT-PCR分析? 檢測8次樹皮樣品的cDNA模板濃度，按熒光定量分析試劑盒的建議調(diào)整各個cDNA樣品的使用濃度，盡量保證所有分析樣品中包含大致相近的cDNA量。利用Premier 5.0軟件，設(shè)計橡膠樹樹皮表達主要HbACO基因的qRT-PCR引物，委托北京六合華大基因科技有限公司合成（表2）。根據(jù)FastStart Essential DNA Green Master試劑盒說明書進行樹皮主要HbACO基因的qRT-PCR分析，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行計算。

1.2.4? 原核表達載體的構(gòu)建及蛋白誘導(dǎo)表達? 使用海南壹田生物科技有限公司的Nimble Cloning原核表達系統(tǒng)試劑盒，根據(jù)說明書將篩選出來的主要HbACO基因克隆到表達載體pNC-ET28上，

并對構(gòu)建好的重組表達載體pNC-ET28- HbACO進行測序鑒定。將pNC-ET28-HbACO和pET28a空載（對照）分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，挑單菌落接種于含有卡那霉素（100 mg/ mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃（220 r/min）培養(yǎng)過夜，按1∶100的比例擴大培養(yǎng)菌液至OD600=0.5～0.8。最后用濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達3.5 h后，于4 ℃離心收集菌體[16-19]。SDS-PAGE和Western Blot實驗按照分子克隆實驗指南進行[20]。用ddH2O重懸菌體，在超聲破碎儀上破碎菌體，離心并取上清。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，通過半干轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸基纖維素膜上，加入一抗（HbACO特異性抗體），孵育2 h后加入二抗（羊抗小鼠IgG）孵育1 h，然后進行顯色（或顯影）并拍照。HbACO特異性抗體的制備是基于HbACOs基因家族氨基酸序列多重比對結(jié)果，選擇高保守且預(yù)測免疫原性強的肽段（PKPDLIKGLR），委托艾比瑪特（Abmart）生物醫(yī)藥（上海）有限公司進行肽段合成和抗體制備（貨號CL027249）。

1.2.5? ACO酶活測定? 用100 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）重懸收集到的菌體，在超聲波破碎儀上破碎菌體，離心并取上清，再用海貍公司的鎳離子螯合磁珠純化融合表達蛋白[18]。檢測純化后的融合蛋白濃度，稀釋到適當(dāng)濃度，取200 μL稀釋后的溶液注入盛有1.8 mL酶反應(yīng)液的20 mL進樣瓶中。反應(yīng)液成分：100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），30 mmol/L抗壞血酸鈉，30 mmol/L NaHCO 1.0 mmol/L ACC，0.1 mmol/L FeSO4，10%甘油（V/V）。30 ℃水浴中密閉保溫35 min后，抽取頂空氣體（0.2 mL），用GC-MS測定乙烯生成量[21-25]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? HbACOs基因家族的克隆及鑒定

從表3可見，克隆的8個HbACOs基因與基因組預(yù)測的編碼區(qū)長度均一致，其中2個基因（HbACO2和HbACO7）的編碼序列也與基因組預(yù)測的完全一致，但其余6個基因與基因組預(yù)測的有少量堿基差異，這其中有3個基因（HbACO1、HbACO4和HbACO5）存在少量氨基酸序列的差別。8個HbACOs家族基因核苷酸序列一致性為55.89%～93.06%，氨基酸一致性為45.09%～ 95.28%。分析蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，均存在高度保守的2OG-FeII_Oxy超家族結(jié)構(gòu)域（圖1）。

圖中紅線標(biāo)注部分為2OG-FeII_Oxy超家族結(jié)構(gòu)域。

2.2? 橡膠樹樹皮主要HbACOs基因的篩選

HbACOs基因在橡膠樹不同組織中的表達情況顯示（圖2），HbACOs基因家族所有基因在膠乳中都幾乎不表達;HbACO1、HbACO5在不同組織中的表達量普遍比較低，一些組織甚至檢測不到表達;HbACO3和HbACO8主要在葉片、花中表達;HbACO2在除葉片和膠乳外的其他組織中都有較高的表達;HbACO4在種子中的表達量高，而在其他組織中表達水平都很低，屬于種子特異性表達基因;HbACO7在樹皮和根中表達量都較高，而在其他組織中都幾乎不表達;HbACO6在除膠乳外的6種組織中都有表達，其中樹皮中的表達量最高。由圖3可知，樹皮中HbACO7的表達量最高，其次是HbACO6，最后是HbACO2，而其他4個HbACO基因的表達量很低或未表達。因此，推測HbACO7可能是橡膠樹樹皮中參與乙烯合成的主效ACO基因。

2.3? HbACO7基因表達的月份變化

為了研究HbACO7的表達量是否受外界環(huán)境的影響，以割膠季節(jié)5—12月的樹皮總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，通過qRT-PCR的方法檢測HbACO7基因在不同割膠月份間的相對表達量。如圖4所示，HbACO7表達量在整個割膠季中隨月份呈現(xiàn)先升高后降低再升高的波動變化趨勢。HbACO7在8月6日（7月底遇臺風(fēng)天氣，導(dǎo)致原定的7月下旬割膠無法實施）的表達量最高，其次為8月27日，再次為12月25日、6月27日、10月25日和9月25日，最低為5月24日和11月23日。

2.4? HbACO7基因的原核表達及酶活測定

2.4.1? 原核表達載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達? HbACO7基因cDNA編碼序列長度為921 bp，編碼306個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為34.8 kDa。將HbACO7基因的編碼區(qū)連接到pNC-ET28載體上構(gòu)建原核表達載體，將構(gòu)建好并經(jīng)測序比對驗證的重組載體pNC-ET28-HbACO7轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明（圖5），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達出一條略大于35 kDa的特異性蛋白條帶，其大小與預(yù)測的HbACO7融合蛋白的大小（約為34.8 kDa）一致。Ni柱純化獲得的HbACO7融合蛋白與未純化的目標(biāo)蛋白大小一致。Western blot實驗也顯示誘導(dǎo)表達獲得了HbACO7的融合表達蛋白（圖6）。

2.4.2? 酶活測定? 將純化后的HbACO7融合蛋白（濃度為0.06 μg/mL）稀釋20倍后進行酶活性分析。結(jié)果表明，HbACO7融合蛋白在酶活反應(yīng)中能催化ACC生成乙烯。如圖7A所示，產(chǎn)生的乙烯峰是一個明顯的單峰，峰面積為1. 與乙烯標(biāo)準(zhǔn)氣體產(chǎn)生的單峰（圖7C）一致。而經(jīng)高溫（100 ℃）滅活的HbACO7融合蛋白產(chǎn)生的峰面積僅為0.12（圖7B），不及未滅活HbACO7融合蛋白產(chǎn)生的峰面積的1/10。根據(jù)乙烯測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到HbACO7融合蛋白的酶活性為1727.24 nL/（mgh）。

3? 討論

乙烯是一種體內(nèi)含量非常微小的氣態(tài)植物激素，但在植物整個生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，它參與了植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育、果實成熟、組織衰老和脅迫應(yīng)答等生命過程的調(diào)節(jié)[10]。橡膠樹受到割膠、碰撞等機械傷害后的樹皮組織立即有傷害乙烯生成，約1 d內(nèi)消失，經(jīng)過停滯期，誘發(fā)傷害誘導(dǎo)乙烯，促進產(chǎn)膠和排膠[13]。乙烯利作為提高天然橡膠產(chǎn)量的刺激劑己經(jīng)被植膠者廣泛使用，乙烯利刺激橡膠樹割膠技術(shù)的發(fā)明及應(yīng)用，對天然橡膠產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了重大影響[28]。研究表明用乙烯利處理橡膠樹，實際上是人為外加乙烯，制造傷害反應(yīng)，強度大于一般傷害，加大再生愈傷反應(yīng)和割膠傷害反應(yīng)，可增加膠乳產(chǎn)量[7， 29]。

乙烯能提高橡膠樹的膠乳產(chǎn)量，因而對乙烯的生物合成途徑的研究顯得尤為關(guān)鍵。植物乙烯生物合成途徑主要包括了3個反應(yīng)：首先是甲硫氨酸在S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）催化下變成S-腺苷甲硫氨酸（SAM），緊接著生成的SAM在ACC合成酶（ACS）的催化下生成乙烯的前體物質(zhì)氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC），最后ACC被ACO氧化產(chǎn)生乙烯。乙烯生物合成途徑的2個關(guān)鍵酶ACS和ACO在成熟的果實和衰老的花器官中均受誘導(dǎo)表達，參與調(diào)控乙烯的生物合成[12]，有關(guān)ACS和ACO基因的研究對探索乙烯生物合成途徑中的分子調(diào)控具有重要意義。在生化分子水平上，對ACS基因的研究取得比較大的進展，而在ACO基因的研究上相對較少，進展緩慢[6]。對橡膠樹中ACO基因功能和其在乙烯生物合成途徑中作用的研究，不僅有助于了解乙烯刺激刺激膠乳產(chǎn)量的機制，也有助于深入了解乙烯對植物的生理效應(yīng)及調(diào)控機理，對乙烯響應(yīng)外界刺激反應(yīng)的分子機理研究也有借鑒意義。

基于上述文獻報道，推測膠乳產(chǎn)量可能與乙烯生物合成途徑的關(guān)鍵ACO基因家族的表達量相關(guān)。植物ACO基因具有明顯的組織特異性表達模式[30]。收集天然橡膠的主要方式是通過割膠方式切斷樹皮乳管，讓膠乳從乳管中流出，這個過程引致機械傷害，可在樹皮組織中檢測到乙烯的產(chǎn)生[4]。結(jié)合HbACOs基因家族在膠乳中幾乎不表達的結(jié)果，推測橡膠樹樹皮組織是產(chǎn)生機械傷乙烯的重要場所，生成的乙烯又能擴散到樹皮乳管中促進膠乳的產(chǎn)生和排出。由此，我們在研究HbACOs基因時，重點關(guān)注其在樹皮中的表達量。本研究發(fā)現(xiàn)HbACO7基因在與產(chǎn)膠密切相關(guān)的橡膠樹莖干樹皮中的表達量最高，可能為樹皮中參與乙烯生物合成的HbACOs家族的主效基因，而具體在樹皮何種組織中表達有待于進一步的實驗研究。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，HbACO7基因的表達量在割膠季節(jié)的7個月份中變化幅度較大。分析7個月中的氣象數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)5～10月份的平均溫度變化不大，而降水量變化較大，特別是8月份的臺風(fēng)使降水量達到最大值，而這時的HbACO7基因表達量也處于一年中的最大值。因此，推測氣象條件中的降水量是影響HbACO7基因表達量高低和內(nèi)源乙烯產(chǎn)量的重要因子。另一方面，鑒于機械傷害可以明顯誘導(dǎo)橡膠樹樹皮產(chǎn)生傷乙烯[13-14]，推測臺風(fēng)天氣造成的橡膠樹機械損傷也可能也是HbACO7基因在8月份表達量高的另一個重要因素。此外，也可能是由于臺風(fēng)降水等天氣導(dǎo)致膠農(nóng)減少割膠次數(shù)，而影響HbACO7基因的表達。

為了驗證HbACO7基因是否編碼具有生理活性的ACO酶，本研究構(gòu)建了該基因的原核表達重組載體pNC-ET28-HbACO7，并成功實現(xiàn)了其HbACO7融合蛋白的原核表達和純化，并對該蛋白進行了酶活測定。結(jié)果顯示，HbACO7融合蛋白具有明顯的ACO酶催化活性，能體外催化ACC產(chǎn)生乙烯。因此，我們認(rèn)為橡膠樹樹皮中表達的主要HbACO基因HbACO7具有體內(nèi)催化乙烯生物合成的生理功能。

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