武文鵬，谷栩萌，孫興華，王春霞△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)又稱為老年性癡呆，是一種常見的老年神經(jīng)系統(tǒng)變性病[1-3]，以進行性的智能衰退、精神行為異常為臨床表現(xiàn)[4-5]，以老年斑及神經(jīng)元纖維纏結為病理特征[6-8]。隨著人口老年化加劇，阿爾茨海默病的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，且已成為僅次于惡性腫瘤和心腦血管疾病的重要致死性疾病。迄今尚無有效的預防與治療阿爾茨海默病的策略[9-10]。已有研究表明，炎癥反應參與阿爾茨海默病的發(fā)生與發(fā)展的過程，慢性持續(xù)性神經(jīng)炎癥反應可導致阿爾茨海默病漸進性神經(jīng)損傷[11-13]。針灸療法在阿爾茨海默病的防治中發(fā)揮著重要作用，并被廣泛應用于臨床[14-16]。但有關針刺調控阿爾茨海默病神經(jīng)炎癥反應的研究較少。因此，本研究從神經(jīng)炎癥反應通路入手，通過雙側海馬區(qū)注射Aβ制備大鼠AD模型，通過測定IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA轉錄水平和COX-2、NF-κB的蛋白表達水平，探討頭穴叢刺對NF-κB信號通路的調控，了解其抗炎反應機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀器 大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)；超速冷凍離心機(型號：H-2050R，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；熒光定量PCR儀(型號：Exicycler 96，韓國BIONEER公司)；徠卡RM2135型切片機(德國Leica)；Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國Motic公司)；LKB-V型超薄切片機(瑞士BROMMA公司)。

1.1.2 試劑 淀粉樣β蛋白片段1-42(批號：MB3894，大連美倫生物技術有限公司)；COX-2免疫組化試劑盒(貨號：BA3708，武漢博士德生物公司)；NF-κB免疫組化試劑盒(貨號：A00284-1，武漢博士德生物公司)；兔抗多克隆一抗(北京博奧森生物技術有限公司)；兔抗多克隆二抗PV6001(北京中杉金橋生物技術有限公司)；DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)；IL-1β ELISA試劑盒(貨號：EK0393，武漢博士德生物公司)；IL-6 ELISA試劑盒(貨號：EK0412，武漢博士德生物公司)；TNF-α ELISA試劑盒(貨號：EK0526，武漢博士德生物公司)；TRIpure(貨號：RP1001，北京百泰克生物技術有限公司)；Super M-MLV反轉錄酶(貨號：PR6502，北京百泰克生物技術有限公司)；RNase inhibitor(貨號：RP5602，北京百泰克生物技術有限公司)；2×Power Taq PCR MasterMix(貨號：PR1702，北京百泰克生物技術有限公司)；SYBR Green(貨號：SY1020，北京百泰克生物技術有限公司)。

1.2 實驗動物與分組

1.2.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠70只，雄性，3月齡，體質量(220±20)g，購買于黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(黑)2016004]。

1.2.2 動物分組 適應性飼養(yǎng)7 d后將過于遲鈍或反應特別敏感的大鼠剔除，保留60只大鼠作為實驗用。按隨機原則，分出12只為正常組，再分出12只為假手術組，其余大鼠用于AD模型制備。取AD造模成功大鼠24只，按照隨機數(shù)字表法分為模型組和頭穴叢刺組，每組各12只。

1.3 AD模型制備

采用雙側海馬內注射Aβ1-42誘導AD模型。采用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射進行麻醉，固定大鼠于腦立體定位儀上，以Bregma為0點，向后3 mm,左右旁開1.5 mm，鉆顱骨打孔，應用微量進樣器經(jīng)打孔處進針，深入顱內3 mm，將Aβ1-42溶液2.5 μg/μL緩慢注入，注射速度為0.5 μL/min，留針5 min。退針后，縫合頭皮并切口消毒。假手術組除用等量生理鹽水代替Aβ1-42溶液外，其余同模型組。

1.4 干預方法

1.4.1 頭穴叢刺組 造模成功后第7天開始，參照《實驗針灸學》[17]取穴，取百會穴及百會穴左側旁開1 mm處、百會穴右側旁開1 mm，用0.35 mm×15 mm毫針針刺，針刺深度約2 mm，每穴平補平瀉快速捻轉1 min，留針30 min，1次/d，連續(xù)干預14 d。

1.4.2 正常組 不給予任何處理，正常飼養(yǎng)。

1.4.3 假手術組、模型組 同時段抓取、捆綁固定30 min，不進行其他處理。

1.5 檢測指標

1.5.1 免疫組化法檢測海馬組織COX-2、NF-κB的表達 最后1次Morris水迷宮實驗結束后，每組取6只大鼠，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，斷頭取腦組織，在冰臺上剝離雙側海馬組織，并稱重，將樣品放入4%多聚甲醛固定液中固定48 h。隨后進行脫水、透明、浸蠟、組織包埋及切片。切片常規(guī)脫蠟到水，按照免疫組化試劑盒說明書進行具體步驟，微波修復、滴加一抗、滴加二抗、DAB顯色、蘇木素復染、常規(guī)脫水透明和中性樹膠封片，Motic3000顯微攝影系統(tǒng)下采集圖片，并統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。

1.5.2 實時熒光定量PCR法檢測海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA的表達 采用實時熒光定量PCR法，取各組大鼠海馬組織，使用TRIpure試劑盒提取總RNA，進行一步法RT-PCR反應，檢測IL-1β、IL-6及TNF-α水平。反應體積20 μL cDNA樣本。反應體系含cDNA模板1 μL、上下游引物(10 μM)各0.5 μL和SYBR GREEN mastermix10 μL，用ddH2O補足至20 μL。引物設計由生工生物工程(上海)有限公司根據(jù)Real-time PCR引物設計原則合成。IL-1β、IL-6及TNF-α基因序列：IL-1β基因序列上下游引物分別為：ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACT和CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT，擴增長度257 bp；IL-6基因序列上下游引物分別是：GTTGCCTTCTTGGGACTGATG和TACTGGTCTGTTGTGGGTGGT，擴增長度102 bp；TNF-α基因序列上下游引物分別是：CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA和TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC，擴增長度175 bp?；颚?actin基因序列引物上下游引物分別是：CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC和ATGGAGCCACCGATCCACA，擴增長度171 bp。Real-time PCR儀反應條件：94.00 ℃，5 min；94.00 ℃，10 s；60.00 ℃，20 s；72.00 ℃，30 s;共40個循環(huán)。反應結束后，進行溶解曲線分析。根據(jù)RealTimePCR原始檢測結果，按照2-△△ct相對定量計算公式計算出各樣品的目的基因相對定量結果。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB的表達比較

與正常組比較，假手術組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB表達量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB表達量明顯降低(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB的表達比較

注：COX-2：a.正常組；b.假手術組；c.模型組；d.針刺組。NF-κB：e.正常組；f.假手術組；g.模型組；h.針刺組。圖1 各組大鼠海馬組織HE染色圖(400×)

2.2 各組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA表達比較

與正常組比較，假手術組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α基因mRNA表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α基因mRNA表達水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α基因mRNA表達水平均明顯降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA表達比較

注：a、b：IL-1β基因實時擴增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖；c、d：IL-6基因實時擴增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖；e、f：TNF-α基因實時擴增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖。圖2 基因實時擴增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖

3 討論

阿爾茨海默病是以細胞內的神經(jīng)原纖維纏結(NFT)、細胞外的β-淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊和神經(jīng)元丟失為病理特征的多因素和異質性神經(jīng)退行性疾病。阿爾茨海默病的病因及發(fā)病機制至今仍未明確，有β-淀粉樣蛋白異常聚集、Tau蛋白過度磷酸化、線粒體功能障礙、神經(jīng)炎癥、氧化應激、代謝障礙胰島素抵抗、興奮性氨基酸毒性、突觸功能障礙及菌群-腸-腦軸失調等假說[18-21]。不同假說的發(fā)病機制之間存在相互的作用，任何單一假說均不能完全解釋阿爾茨海默病的發(fā)病全過程，為多種機制共同作用的結果。

阿爾茨海默病屬于中醫(yī)學“癡呆”范疇。中醫(yī)學對本病的認識較早，如《景岳全書·雜病謨》曰：“癡呆證，凡平素無痰，而或以郁結，或以不遂，或以思慮，或以疑惑，或以驚恐，而漸至癡呆，言辭顛倒，舉動不經(jīng)……其證則千奇萬怪，無所不至?！敝嗅t(yī)藥在延緩阿爾茨海默病的進展及提高患者體質方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。頭穴叢刺針法是以中醫(yī)學經(jīng)絡理論和現(xiàn)代醫(yī)學神經(jīng)解剖理論為基礎建立起來的以在頭部相應治療區(qū)進行“叢式”的針刺治療疾病的一種方法，被廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療。課題組前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，頭穴叢刺能夠延緩阿爾茨海默病的進展，改善患者的認知功能。但有關頭穴叢刺治療阿爾茨海默病作用機制的研究報道較少。因此，探究中醫(yī)藥防治阿爾茨海默病的思路與途徑具有重要的價值與意義。

神經(jīng)炎癥反應機制是近年來阿爾茨海默病研究的熱點和焦點，被認為是阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展的重要致病因素，其中細胞因子和免疫相關基因是關鍵的參與者，在阿爾茨海默病的病理生理學機制中發(fā)揮著重要作用[22-25]。有研究發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默病患者的大腦中存在補體防御蛋白、細胞因子及急性期反應物等炎癥指標[26]。β-淀粉樣蛋白具有強烈的誘導神經(jīng)元凋亡和DNA損傷的作用，β-淀粉樣蛋白能夠激活星形膠質細胞和小膠質細胞，并促進其釋放炎癥因子。小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細胞，其重要的生理功能是通過分泌細胞因子維持組織環(huán)境的穩(wěn)定，其釋放的細胞因子包括促炎因子(如IL-6、IL-12、IL-18、IL-1β及TNF-α等)和抗炎因子(如TGF-β、IL-10等)。有研究表明，小膠質細胞不僅能夠直接吞噬可溶性β-淀粉樣蛋白，還能夠通過細胞外蛋白酶對不可溶性寡聚體狀態(tài)的β-淀粉樣蛋白進行溶解[27]。當β-淀粉樣蛋白異常聚集時，能夠使炎癥因子持續(xù)分泌，最終發(fā)展成慢性炎癥反應，使神經(jīng)元變性損傷加重，同時持續(xù)分泌的炎癥因子能夠下調細胞表面的β-淀粉樣蛋白吞噬受體表達，進而影響小膠質細胞的吞噬功能。迄今為止，已有包括IL-1β、IL-6及TNF-α在內的13種細胞因子與阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展有關[28]。IL-1β在體液和細胞免疫中起始動作用，能夠誘發(fā)炎性反應，IL-1β過度表達能夠使小膠質細胞表達TNF-α和IL-6等炎性因子上調，進而誘導β-淀粉樣蛋白的前體蛋白過度生成。此外，在動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，IL-1β過表達的阿爾茨海默病轉基因小鼠可使其中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥反應加重；IL-1β能夠誘導阿爾茨海默病動物模型大鼠皮質神經(jīng)元發(fā)生Tau蛋白磷酸化等特征性病理改變[29]。TNF-α是免疫和炎癥過程中的關鍵細胞因子，主要由免疫細胞釋放，在機體的各個部位發(fā)揮著重要作用。在阿爾茨海默病患者尸檢的腦組織β-淀粉樣蛋白斑塊周圍發(fā)現(xiàn)TNF-α的存在，這是其參與阿爾茨海默病之間聯(lián)系的直接證據(jù)[30]。IL-6作為免疫炎性調節(jié)因子，在維持細胞存活、能量代謝平衡及神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著重要作用。在阿爾茨海默病模型小鼠中發(fā)現(xiàn)IL-6過表達，并增加小膠質細胞對β-淀粉樣蛋白的吞噬作用，同時增加TNF-α及其他炎性反應介質的釋放[31]。本實驗結果表明，模型組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α基因mRNA表達水平均顯著升高，提示模型組大鼠神經(jīng)炎性反應增強；與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α基因mRNA表達水平均明顯降低，提示頭穴叢刺能夠抑制大鼠神經(jīng)炎性反應。

NF-κB是細胞內重要的核轉錄因子，是大腦的多種神經(jīng)元基因靶點，參與機體的神經(jīng)傳遞、細胞生長、免疫應答、炎癥反應、細胞凋亡及其應激反應等。β-淀粉樣蛋白肽是老年斑的主要成分，其能夠刺激NF-κB活性，而NF-κB抑制劑能夠減少β-位點APP裂解酶1的生成及減少β-淀粉樣蛋白前體的產(chǎn)生。有研究表明，NF-κB信號通路的激活在β-淀粉樣蛋白前體被分泌酶活性蛋白水解而產(chǎn)生致病性β-淀粉樣蛋白過程中起著重要作用[32-33]。致病性β-淀粉樣蛋白聚集體能夠使神經(jīng)元細胞的炎癥反應增強，導致IL-1β、IL-6及TNF-α等炎癥因子大量釋放。COX-2是NF-κB信號轉導的靶基因之一，與阿爾茨海默病的炎性反應過程密切相關[34]?；罨腘F-κB與其在COX-2啟動區(qū)域的結合位點結合，能夠促進COX-2表達，活化的COX-2通過炎癥反應等導致腦損傷，進而參與阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展[35]。本實驗結果表明，模型組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB表達量顯著升高，提示模型組大鼠COX-2、NF-κB活化增強；與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB表達量明顯降低，提示頭穴叢刺能夠抑制COX-2、NF-κB活化。

綜上所述，運用頭穴叢刺針刺法能夠抑制NF-κB通路蛋白表達而調控炎性細胞因子而減少阿爾茨海默病模型大鼠的炎性反應。