段浩茹，歐陽(yáng)夏荔，金 琪，羅 雪，韓 麗△，趙百孝,趙思雨,張高鈺,王中鈺

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京 100040)

子宮是女性產(chǎn)生月經(jīng)、孕育胎兒和維持內(nèi)分泌平衡的重要器官，但其衰老速度快于機(jī)體其他部位。一方面，子宮易受壓力、不良生活習(xí)慣等因素的影響而衰老；另一方面隨著年齡的增長(zhǎng)，女性腎氣、天癸漸衰、沖任漸虛和生殖功能逐漸減弱。子宮衰老不僅表現(xiàn)在大小、內(nèi)膜的變化[1]，其功能亦逐漸衰退，進(jìn)而引起內(nèi)分泌紊亂，出現(xiàn)多種婦科疾病，使機(jī)體提前進(jìn)入更年期[2]?！瓣P(guān)元”穴艾灸不僅用于保健防病，還善于治療生殖系統(tǒng)疾病，可調(diào)節(jié)子宮功能、延緩子宮衰老，但其機(jī)制尚未闡明。細(xì)胞周期阻滯與氧化應(yīng)激參與衰老的發(fā)生發(fā)展，本實(shí)驗(yàn)以此為切入點(diǎn)，以12月齡Wistar雌性大鼠子宮組織為研究對(duì)象，對(duì)“關(guān)元”穴進(jìn)行溫和灸干預(yù)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，觀察艾灸對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及機(jī)體抗氧化酶水平的影響，并分析兩者的相關(guān)性，進(jìn)而探索艾灸延緩子宮衰老的機(jī)理，最終為臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

本實(shí)驗(yàn)選取SPF級(jí)12月齡Wistar雌性大鼠14只，體質(zhì)量(359.62±31.86)g，SPF級(jí)3月齡Wistar雌性青年大鼠7只，體質(zhì)量(281.43±21.00)g。動(dòng)物由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006]。于空氣流通、自然光線充足、溫度(24±2)℃和相對(duì)濕度30%～60%的條件下分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1個(gè)月，若無(wú)不良反應(yīng)，則納入正式實(shí)驗(yàn)。適應(yīng)性飼養(yǎng)及正式實(shí)驗(yàn)時(shí)期，動(dòng)物自由攝食和飲水。

適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組。其中12月齡大鼠隨機(jī)分為艾灸組和對(duì)照組，每組7只；3月齡青年大鼠7只為青年組。實(shí)驗(yàn)遵照國(guó)家科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的要求進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑 大鼠細(xì)胞周期素D1酶聯(lián)免疫試劑盒(Rat CyclinD1 ELISA Kit RGB& CHN Lot: 20190301.60482R);大鼠周期素依賴性激酶4酶聯(lián)免疫試劑盒(Rat CDK4 ELISA Kit RGB& CHN Lot: 20190413.60481R);大鼠轉(zhuǎn)錄因子E2F-1酶聯(lián)免疫試劑盒(Rat E2F1 ELISA Kit RGB& CHN Lot: 20190413.60513R)、超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒(Tatol Superoxide Dismutase Kit 南京建成&CHN Lot: 20181218);過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒[Catalase (CAT) assay kit 南京建成&CHN Lot: 20190410.40051]。

1.2.2 儀器 Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó))；Thermo Multiskan MK3(芬蘭)。

1.3 干預(yù)方法

1.3.1 艾灸組 采用特制大鼠固定器固定大鼠，使其暴露穴位區(qū)域并保持清醒狀態(tài)。穴位選取:參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]并結(jié)合大鼠骨骼及體型取“關(guān)元”穴，并對(duì)所有大鼠穴區(qū)直徑1 cm左右區(qū)域進(jìn)行備皮。將特制艾條(長(zhǎng)約5 cm，直徑約0.5 cm，河南南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限公司)點(diǎn)燃后置于“關(guān)元”穴下方2 cm左右的位置，并在施灸過(guò)程中調(diào)整其與穴區(qū)的距離，以穴區(qū)皮膚微紅、大鼠相對(duì)安靜、無(wú)劇烈掙扎和嘶吼為度。每日1次，治療20 min，連續(xù)40 d為1個(gè)療程，療程結(jié)束后取材檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 對(duì)照組 與干預(yù)組進(jìn)行同樣的抓取與固定，每日1次，共40 d。

1.3.3 青年組 與干預(yù)組進(jìn)行同樣的抓取與固定，每日1次，共40 d。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠24 h禁食不禁水，按0.8 mL/100 g藥量比腹腔注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。麻醉后取大鼠子宮組織，于液氮速凍后凍存于-80℃冰箱備用。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)大鼠子宮組織中細(xì)胞周期素D1酶(CyclinD1)、周期素依賴性激酶4(CDK4)、轉(zhuǎn)錄因子E2F-1(E2F1)、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的水平，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 艾灸對(duì)各組大鼠子宮組織SOD、CAT含量的影響

與青年組比較，對(duì)照組大鼠子宮組織中SOD、CAT含量降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，艾灸組大鼠子宮組織中SOD、CAT含量上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 干預(yù)后各組大鼠子宮組織SOD、CAT水平比較

2.2 艾灸對(duì)各組大鼠子宮組織CyclinD1、CDK4和E2F1含量的影響

與青年組比較，對(duì)照組大鼠子宮組織CyclinD1、CDK4和E2F1水平均有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與對(duì)照組比較，艾灸組大鼠CyclinD1、CDK4和E2F1水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 干預(yù)后各組大鼠子宮組織CyclinD1、CDK4和E2F1水平比較

2.3 各組大鼠子宮組織CyclinD1與SOD、CAT的相關(guān)性分析

為探究大鼠子宮組織中細(xì)胞周期重要調(diào)節(jié)因子CyclinD1與子宮組織抗氧化能力是否有相互作用，在排除其他指標(biāo)的影響后，對(duì)各組大鼠子宮組織中的CyclinD1與SOD、CAT含量分別做了相關(guān)性分析，結(jié)果表明，各組大鼠子宮組織中的CyclinD1與SOD、CAT均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表3～4。

表3 各組大鼠子宮組織CyclinD1與SOD的相關(guān)分析結(jié)果

表4 各組大鼠子宮組織CyclinD1與CAT的相關(guān)分析結(jié)果

2.4 CyclinD1/CDK4/E2F1通路作用機(jī)制

在G1期間，CyclinD1表達(dá)并與CDK4形成復(fù)合物，磷酸化激活Rb并使其與E2F1解離，游離的E2F1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。見(jiàn)圖1。

圖1 CyclinD1/CDK4/E2F1通路作用機(jī)制示意圖

3 討論

女性子宮衰老伴隨著形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的逐漸衰退。子宮的生理功能與生理周期受肝、脾和腎的調(diào)節(jié)，其經(jīng)脈可通過(guò)任脈聯(lián)系于胞宮。關(guān)元是強(qiáng)壯之要穴，是任脈與足三陰經(jīng)的交會(huì)穴，元陰元陽(yáng)交關(guān)之所，具有內(nèi)系元陽(yáng)、藏精和維系胞宮等作用，為婦科疾病的常用穴。艾灸關(guān)元不僅能夠固本培元、延緩衰老，還能補(bǔ)益下焦、調(diào)理生殖系統(tǒng)疾病。正如《扁鵲心書(shū)》記載:“人于無(wú)病時(shí)，常灸關(guān)元、氣海、命門(mén)、中脘，雖未得長(zhǎng)生，亦可保百年壽也”。又云:“余五十時(shí)，常灸關(guān)元百余壯，漸至身體輕健，羨進(jìn)飲食，每年常如此灸，遂得老年康健?！庇纱丝梢?jiàn)，關(guān)元穴可作為保健灸的常用穴位。因此，本研究旨在觀察艾灸“關(guān)元”穴對(duì)衰老進(jìn)程中大鼠子宮組織的影響，進(jìn)一步探究其抗子宮衰老的作用機(jī)制。

自由基的異常堆積是導(dǎo)致子宮衰老的重要因素。人體內(nèi)含有低濃度的自由基，可維持機(jī)體氧化與抗氧化之間的平衡，參與機(jī)體的免疫防御。但隨著年齡的增高，子宮組織清除自由基能力減弱，造成自由基的異常增多。自由基與含氧物質(zhì)相結(jié)合發(fā)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而可破壞細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，加速細(xì)胞衰老。因此，降低自由基的氧化損害可延緩子宮衰老。過(guò)氧化氫酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)是機(jī)體清除自由基最主要的抗氧化酶，SOD負(fù)責(zé)將毒性強(qiáng)的自由基轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘暂^低的H2O2，CAT則可清除SOD歧化反應(yīng)與脂質(zhì)代謝中產(chǎn)生的H2O2[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5-7]，灸療可提高衰老實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清、骨骼肌和子宮等組織中SOD和CAT含量，促進(jìn)自由基的清除，進(jìn)而緩解組織老化。本實(shí)驗(yàn)利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法研究艾灸對(duì)衰老進(jìn)程大鼠子宮組織SOD、CAT含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠子宮組織SOD、CAT含量明顯降低，而艾灸可上調(diào)上述蛋白含量，提示艾灸可通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力來(lái)達(dá)到清除自由基、延緩衰老的目的。

衰老表現(xiàn)為機(jī)體細(xì)胞、組織生理功能漸進(jìn)性退化，細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞分裂增殖減慢。細(xì)胞周期包括分裂間期與分裂期，分裂間期由G1期、S期和G2期組成。細(xì)胞生長(zhǎng)分裂過(guò)程中，必須經(jīng)過(guò)G1期與S期之間的關(guān)卡調(diào)控點(diǎn)，而當(dāng)細(xì)胞老化時(shí)細(xì)胞阻滯于G1期，無(wú)法進(jìn)入S期[8]。G1/S期調(diào)控點(diǎn)受CyclinD1/CDK4/E2F1信號(hào)通路的調(diào)控。細(xì)胞周期素D1酶(CyclinD1)、周期素依賴性激酶4(CDK4)是G1/S期轉(zhuǎn)化的正性調(diào)控因子，可加快細(xì)胞周期進(jìn)程[9]。通過(guò)抑制CDK4活性可誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯和細(xì)胞衰老[10]。研究發(fā)現(xiàn)放射性腦細(xì)胞衰老模型CDK4表達(dá)減少[11]；衰老動(dòng)物腸黏膜、子宮組織CyclinD1含量降低[12]。姚暉等[13]采用蛤蟆油灌胃治療可顯著提高CyclinD1蛋白含量，改善大鼠的衰老狀態(tài)。E2F1同樣是調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白，其活性受視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白(Rb)的調(diào)節(jié)[14]。E2F1與Rb結(jié)合時(shí)無(wú)法發(fā)揮作用，當(dāng)Rb受CyclinD1與CDK4結(jié)合形成的復(fù)合物刺激時(shí)可磷酸化激活[15]，進(jìn)而與E2F1解離，游離的E2F1則發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性從而使細(xì)胞完成G1/S期的轉(zhuǎn)變[14]。作用機(jī)制見(jiàn)圖1。研究發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞中E2F1與靶基因結(jié)合減弱[16]。由Sirtinol誘導(dǎo)的早衰細(xì)胞中，Rb的磷酸化嚴(yán)重下調(diào)；但采用Sirtinol抑制劑處理后，細(xì)胞中E2F1活性明顯增強(qiáng)[17]。以上研究數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞衰老時(shí)細(xì)胞周期阻滯，E2F1與CDK4、CyclinD1表達(dá)減弱。

實(shí)驗(yàn)研究[18-19]發(fā)現(xiàn)艾灸可以降低G1期細(xì)胞比例，升高細(xì)胞的增值(PI)指數(shù)，使細(xì)胞順利進(jìn)入S期，進(jìn)而延緩衰老。杜艷等[20]提示艾灸可促進(jìn)Rb的磷酸化，抑制抑癌基因p16的表達(dá)，從而使停滯期的腦神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)入增殖期。p16基因又稱衰老相關(guān)基因，與CyclinD1相拮抗，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDK4進(jìn)而減弱CDK4/CyclinD1復(fù)合物的活性。故本研究提出假說(shuō)，艾灸可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期重要調(diào)節(jié)因子E2F1、CDK4及CyclinD1蛋白的表達(dá)，增加S期細(xì)胞比例，最終延緩子宮衰老。本研究顯示，與青年組比較，對(duì)抗照組大鼠子宮組織中CyclinD1、CDK4及E2F1蛋白表達(dá)含量均明顯降低，提示子宮衰老進(jìn)程與細(xì)胞周期停滯關(guān)系密切；而經(jīng)艾灸“關(guān)元”穴治療后，大鼠子宮組織上述蛋白含量顯著增高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明艾灸“關(guān)元”穴可調(diào)節(jié)子宮組織CyclinD1、CDK4蛋白表達(dá)，促進(jìn)E2F1的釋放，使細(xì)胞通過(guò)G1期，進(jìn)而對(duì)抗細(xì)胞衰老。

有研究發(fā)現(xiàn)[21]，骨髓衰老造血細(xì)胞增殖能力的下降，細(xì)胞周期的阻滯，衰老相關(guān)蛋白表達(dá)的上調(diào)，與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，故推測(cè)氧化應(yīng)激會(huì)抑制細(xì)胞增殖，參與衰老的發(fā)生發(fā)展。姚暉等[13]在蛤蟆油延緩衰老的實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)雌性衰老大鼠機(jī)體抗氧化作用以及自由基水平變化與CyclinD1、CDK4和pRb等細(xì)胞周期調(diào)控因子具有明顯的相關(guān)性。因此，本實(shí)驗(yàn)在發(fā)現(xiàn)艾灸可提高衰老進(jìn)程中大鼠子宮組織SOD、CAT含量和增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力的基礎(chǔ)上，觀察衰老進(jìn)程中大鼠細(xì)胞周期相關(guān)蛋白與氧化應(yīng)激損傷的關(guān)系，采用spearman法分析CyclinD1/CDK4/E2F1信號(hào)通路中起始分子CyclinD1蛋白表達(dá)情況與SOD、CAT含量的相關(guān)性，以進(jìn)一步揭示艾灸延緩子宮衰老的具體途徑。結(jié)果顯示各組大鼠子宮組織中的CyclinD1與SOD、CAT均無(wú)相關(guān)性，與上述研究結(jié)果不符，進(jìn)一步對(duì)其分析，原因可能有兩方面。其一，艾灸延緩子宮衰老可能是通過(guò)調(diào)節(jié)自由基水平及細(xì)胞周期變化兩條途徑分別進(jìn)行的，體現(xiàn)了艾灸多系統(tǒng)、多層面和多靶點(diǎn)的整體性調(diào)節(jié)特點(diǎn)；其二，本實(shí)驗(yàn)樣本量不夠充分，統(tǒng)計(jì)結(jié)果可能與大樣本存在誤差。

子宮衰老是一個(gè)綜合性過(guò)程，其發(fā)生機(jī)制涉及廣泛，而艾灸的抗衰老作用亦并非通過(guò)單一途徑實(shí)現(xiàn)，因此研究應(yīng)從單一學(xué)說(shuō)逐漸發(fā)展為多學(xué)說(shuō)的綜合性、系統(tǒng)性研究，以便為艾灸的臨床推廣運(yùn)用提供更加全面、可靠的科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，艾灸發(fā)揮作用與灸量關(guān)系密切，在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步探索艾灸時(shí)間、頻率和療程等是否會(huì)對(duì)艾灸療效產(chǎn)生影響，從而保證實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)性。艾灸延緩衰老的時(shí)機(jī)同樣是值得重視的問(wèn)題，在大鼠青年期即采用艾灸干預(yù)，其抗衰老效果是否更加顯著，筆者接下來(lái)的研究中將繼續(xù)深入探討。