許斌洋，楊旭，趙德浚，楊財容，劉松青

（成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 611130）

放線菌是土壤微生物中的一個主要類群，其數(shù)量、種類及活性會影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，進而影響植物的生長。與此同時，放線菌還是一類具有抑菌、抗腫瘤、酶抑制等重要活性的微生物資源，具有巨大的應(yīng)用前景[1]。如臨床上常用的氨基糖苷類、四環(huán)素類、糖肽類及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素等均來自放線菌[1-3]。放線菌還可以合成多種有用的代謝產(chǎn)物，如維生素、淀粉酶、纖維素酶和氨基酸等，與人類的生產(chǎn)生活關(guān)系緊密[4]。隨著放線菌分離研究的不斷深入，大量常見菌株已被反復(fù)研究，因此從中發(fā)現(xiàn)新化合物的概率逐漸降低。為了更高效地發(fā)現(xiàn)新的微生物資源，人們逐漸把目光投向少有研究的特殊生態(tài)環(huán)境中，如海洋、動物共生、植物內(nèi)生、根際土壤以及極端環(huán)境等，從而尋找具有較大利用價值的放線菌資源[5-9]。

青藏高原平均海拔4 000 m，地勢高亢，生態(tài)條件復(fù)雜，這決定了青藏高原放線菌資源具有其獨特性。本研究實驗材料選擇川西高原的垂穗披堿草根際土壤，目前對該地區(qū)較為常見的垂穗披堿草根際土壤放線菌的系統(tǒng)研究較少。而垂穗披堿草又是川西高原的優(yōu)勢草種，分布廣泛，可能是由于放線菌產(chǎn)生活性物質(zhì)，與垂穗披堿草互利共生，相互影響、相互作用。通過對放線菌的形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定、16S rRNA基因擴增比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，篩選出拮抗病原菌的放線菌，為垂穗披堿草牧草的生長生產(chǎn)提供理論依據(jù)，這對川西高原畜牧業(yè)的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境保護具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

實驗材料的土壤樣品共6份，分別采自川西高原的查真梁子（經(jīng)緯度為N32°67'25''、E102°11'59''，海拔4 345 m）、紅原草原（經(jīng)緯度為N32°34'22'、E102°23'12'，海拔3 920 m）、紅原草甸（經(jīng)緯度為 N32° 90'18'、E101° 15'53''，海 拔 3 595 m）、安曲鄉(xiāng)（經(jīng)緯度為 N32° 66'21'、E102° 26'17'，海拔3 455 m）、查理鄉(xiāng)（經(jīng)緯度為N32°76'34'、E102°05'49'，海拔3 299 m）以及馬塘溝（經(jīng)緯度為N31° 53'62'、E102° 37'43'，海拔 3 100 m），編號依次為1、2、3、4、5、6。采集土樣均為0～12 cm的表層土樣，分別用無菌袋裝好放于實驗室4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良高氏一號培養(yǎng)基、l/10BeIlllette agar培養(yǎng)基、腐殖酸培養(yǎng)基、改良淀粉脯氨酸培養(yǎng)基、低營養(yǎng)礦物鹽培養(yǎng)基以及高氏一號培養(yǎng)基。

1.2 儀器

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；BCD-248WBSV型立式冷藏箱，青島海爾股份有限公司；PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；SJ-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；JA3003精密電子天平, 上海良平儀器儀表有限公司；SKY-100C型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海蘇坤實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離

采用土壤懸浮液稀釋涂布平板法分離菌種。從混勻的各備用土樣中隨機稱取1 g自然風(fēng)干的垂穗披堿草根際土壤，在研缽中研磨，通過100 ℃高溫1 h烘干，在準(zhǔn)備好的帶有磁珠的99 mL無菌水中低速搖床（170 r/min，30 ℃）處理1 h，再微波處理30 s混勻后得到稀釋100倍的土壤懸浮液。取1 mL稀釋100倍的土壤懸浮液加入到9 mL無菌水的試管中，混合搖勻得到稀釋1 000倍的土壤懸浮液。取1 mL稀釋1 000倍的土壤懸浮液同樣加入到9 mL無菌水的試管中，混合搖勻后得到稀釋10 000倍的土壤懸浮液。取搖勻后的土樣懸液0.2 mL，涂布于分離平板上，28℃培養(yǎng)2周，得到單菌落。

1.3.2 菌種純化和保藏

通過28 ℃溫度條件下在15 d的培養(yǎng)皿上挑選單個菌落，在改良高氏一號培養(yǎng)基平板上接種，用平板劃線法純化菌株，并挑取純菌株的單菌落接種于改良的高氏一號培養(yǎng)基的斜面上作為菌種的初步保藏。將純化后的菌株用高氏一號液體培養(yǎng)基在28 ℃，搖床中轉(zhuǎn)速170 r/min下培養(yǎng)3～5 d，配制好濃度的50%的甘油，將甘油與菌液按體積比1∶1（V∶V）混合，保藏于-80 ℃冰箱中。

1.3.3 放線菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將保藏于-80 ℃的菌株活化，在改良高氏一號培養(yǎng)基進行插片培養(yǎng)法進行觀察，并記錄肉眼可觀察的放線菌菌落特征，如基內(nèi)菌絲顏色、氣生菌絲顏色、菌落表面含水狀態(tài)以及色素產(chǎn)生情況等。

1.3.4 放線菌對病原菌的抑菌活性的測定

1.3.4.1 菌懸液的制備

將病原菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、枯草芽孢桿菌4株菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37 ℃活化24 h，然后液體培養(yǎng)得到菌懸液。

1.3.4.2 抑菌活性的測定

每個培養(yǎng)皿加入100 μL病原菌的菌懸液，均勻涂布，通過牛津杯法[10]，每皿內(nèi)豎放3個牛津杯，每個牛津杯加入200 μL放線菌的樣品制備液（每個重復(fù)3次）。

1.3.5 生理生化鑒定

（1）唯一碳源的利用：鑒定實驗菌株對不同碳源的利用情況。（2）明膠液化試驗：測定菌種產(chǎn)生蛋白酶的能力。（3）硝酸鹽還原試驗：測定菌種對硝酸鹽的還原能力。（4）纖維素分解試驗：測定菌種產(chǎn)生纖維素酶的能力。（5）硫化氫的產(chǎn)生：檢測菌株生長過程中是否產(chǎn)生H2S[11-13]。

1.3.6 DNA的提取及16S rRNA基因PCR擴增

采用細(xì)菌DNA抽提試劑盒（上海生工生物股份有限公司）提取基因組DNA，擴增引物為通用引物，擴增產(chǎn)物進行測序，在NCBI上進行序列比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察及培養(yǎng)特征

從川西高原的6個土壤樣品中分離5株放線菌，分別命名為YX1、YX2、YX3、YX4、YX5，觀察菌落形態(tài)和菌絲形態(tài)，可以發(fā)現(xiàn)5株菌落均為圓形，有皺褶，其表面干燥，菌落周圍有輻射。菌株的菌絲粗細(xì)不一，長短不同，分支多而且孢子絲不易觀察，結(jié)果如表1。

表1 土壤放線菌的菌落特征與菌絲形態(tài)

2.2 土壤放線菌的抑菌活性的測定

通過牛津杯法測定菌株發(fā)酵液的抑菌活性，結(jié)果見表2。5株菌中，YX1、YX2和YX5的抑菌效果較突出，YX1能夠抑制大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的生長，其中對大腸桿菌的抑制效果較好；YX2能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，其中對大腸桿菌的抑制效果較好；YX3只對枯草芽孢桿菌有抑菌效果；YX4只對銅綠假單胞菌有抑菌效果；YX5能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的生長，其中對大腸桿菌的抑制效果較好，對枯草芽孢桿菌抑菌效果較低敏。

表2 土壤放線菌發(fā)酵液對4種病原菌抑制效果

2.3 土壤放線菌的生理生化鑒定

參照放線菌生理生化鑒定方法對5株放線菌進行生理生化鑒定，鑒定結(jié)果如表3。

表3 各菌株生理生化鑒定結(jié)果

由表3可以看出，所有的菌株均能使淀粉水解，都不能產(chǎn)生H2S和黑色素，均能使明膠液化和牛奶胨化，均能利用葡萄糖，均不能利用蔗糖，只有菌株YX3可以使纖維素分解，只有菌株YX5不能利用果糖，只有YX1和YX3能使硝酸鹽還原。

2.4 土壤放線菌16S rRNA基因PCR擴增結(jié)果

用試劑盒法提取菌株的DNA，經(jīng)過PCR擴增，得到菌株16S rRNA基因序列片段，用瓊脂糖凝膠電泳儀對擴增產(chǎn)物進行檢測，凝膠成像儀進行觀察拍照，發(fā)現(xiàn)1 500 bp相應(yīng)位置都有均一、明亮條帶出現(xiàn)，擴增結(jié)果如圖1，這表明PCR擴增成功，低溫保存。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.5 土壤放線菌系統(tǒng)發(fā)育分析

將PCR產(chǎn)物純化后直接送至上海生工生物股份有限公司進行測序。根據(jù)16S rRNA測序結(jié)果，登陸NCBI在線查詢，對YX1～YX5的序列進行Blast分析（采用16S rRNA序列對 GenBank中的數(shù)據(jù)庫進行搜索），找到其中序列相似性最高的序列（表4），在菌株的16S rRNA序列同源性高達(dá)95%時可以認(rèn)為屬同一屬，當(dāng)序列同源性高達(dá)97%以上可認(rèn)為屬于同一種[14]。通過5株分離菌株的16S rRNA序列測序結(jié)果及其同源菌株在GenBank 中公布的16S rRNA 序列，利用Mega 5軟件采用Neighbor-joining法構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。由系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析可以看出，YX1、YX2、YX4與Streptomyces rishiriensis（NR_044141.1）和Streptomyces rishiriensis（NR_112392.1）親緣關(guān)系較近；YX3與Streptomyces sindenensis（NR_115441.1）聚在一起，可能屬于該菌株；YX5與Streptomyces alboviridis（NR_115374.1）親緣關(guān)系較近。

表4 5株菌株16S rRNA基因序列比對結(jié)果

圖2 基于鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)16S rRNA序列同源性分析結(jié)果顯示，結(jié)合生理生化特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，將YX1、YX2、YX4鑒 定為Streptomyces rishiriensis；YX3鑒 定 為Streptomyces sindenensis；YX5鑒定為Streptomyces alboviridis；YX1～YX5均為鏈霉菌屬（Streptomyces）。

3 討論

本次實驗從川西高原地區(qū)6份土壤中分離純化得到了5株放線菌，通過對5株放線菌的形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定和16S rRNA基因擴增比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，最終鑒定出這5株菌的屬，均為鏈霉菌屬（Streptomyces）。鏈霉菌是產(chǎn)生抗生素活性物質(zhì)最多的一類放線菌，由前人的研究可知，迄今已知的抗生素中，有51%是由鏈霉菌產(chǎn)生的[15]。不少抗生素已用于防治植物上的有害病菌，如井岡霉素、春雷霉素等用于防治植物真菌性病害[16]。在本研究中可以發(fā)現(xiàn)，在川西高原地區(qū)存在重要的具有進一步研究開發(fā)價值的放線菌資源，尤其是鏈霉菌資源，是農(nóng)用和畜牧業(yè)抗生素產(chǎn)生菌的重要分離資源和種質(zhì)資源庫，對于發(fā)展畜牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)有著重要的研究價值。

本研究在分離根際土壤放線菌的基礎(chǔ)上對放線菌進行了生理生化鑒定，可以發(fā)現(xiàn)，5株菌株的淀粉水解能力、明膠液化能力、牛奶胨化能力均較強，而纖維素分解能力較弱，僅只有YX3能夠使纖維素分解，5株菌株不能產(chǎn)H2S，說明均無分解含硫有機物的能力。這與來航線等[17]分離的放線菌生理生化試驗結(jié)果相似。這些菌株對于淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的開發(fā)應(yīng)用提供了研究材料，后期可進一步詳細(xì)研究菌株的產(chǎn)酶條件等相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，對其進行處理改造提高酶的活力和產(chǎn)量，為酶工業(yè)生產(chǎn)提供更多微生物資源。

本研究發(fā)現(xiàn)土壤中放線菌種類和數(shù)量較少，但根據(jù)葉景靜等[18]在廣西茅尾海紅樹林植物根際土壤中發(fā)現(xiàn)放線菌共88株，有6目8科9屬；羅亞軍等[19]在西藏沙棘根瘤及根際土壤中分離放線菌共112株，有7目12科23屬，而本次實驗只分離出5株鏈霉菌屬的菌株，說明土壤中還有更多的放線菌還未分離出來，樊炳君等[20]通過分離桉樹根際土壤放線菌研究發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基上放線菌的生長情況和數(shù)量差異很大。其中，以采樣地土壤制成的培養(yǎng)基放線菌的出菌率最高，推測可能是由于桉樹大量吸收養(yǎng)分而形成的貧營養(yǎng)環(huán)境的選擇作用使得適應(yīng)寡營養(yǎng)的放線菌類群占據(jù)了絕對優(yōu)勢的原因。未來將通過增加篩選培養(yǎng)基的種類和改變抑制劑的種類和配比，來改善放線菌數(shù)量和種類較少的問題，爭取從川西高原篩選到更多有價值的放線菌。羅亞軍等[19]對西藏沙棘根瘤及根際土壤放線菌進行抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，有17株菌至少對一種檢定菌有抗菌活性；潘文娟等[21]對西藏湖泊放線菌進行抗菌活性測定發(fā)現(xiàn)，有55株菌至少對一種檢定菌有抗菌活性，這表明放線菌能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，抑制病原菌生長。本次研究通過牛津杯法對放線菌進行4種病原菌的抑菌活性的測定，發(fā)現(xiàn)YX1、YX2和YX5的抑菌效果較好。這些具有抑菌抗性的放線菌還可以進一步研究其促生功能、抗逆性作用、功能基因以及抗菌活性產(chǎn)物與其藥用價值間的關(guān)系，全面而系統(tǒng)地揭示川西高原垂穗披堿草根際土壤放線菌的藥用價值與應(yīng)用前景，達(dá)到保護垂穗披堿草資源的目的。因此，在后續(xù)的研究工作中，可進一步對這些菌株的抗菌活性進行測定，研究其產(chǎn)生抗菌活性的物質(zhì)，揭示其次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)組成，力求從中發(fā)現(xiàn)具有較好應(yīng)用價值的新型活性物質(zhì)，為新藥的開發(fā)提供依據(jù)。另可針對禾本科常見的病原菌篩選出較好拮抗活性的微生物資源并制作相應(yīng)產(chǎn)品進行應(yīng)用，將有助于川西高原草場的改良，有利于促進我國的畜牧業(yè)發(fā)展和環(huán)境保護事業(yè)。