邱立忠,王德印,劉鵬飛*,吳正宗,李子松,王愛(ài)月,崔 波*

1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,濟(jì)南 250353 2.諸城興貿(mào)玉米開(kāi)發(fā)有限公司,諸城 262218 3.山東興泉油脂有限公司,莒南 276600

玉米作為世界上三大農(nóng)作物之一,產(chǎn)量約占世界粗糧產(chǎn)量的65%,營(yíng)養(yǎng)豐富。玉米油由玉米胚芽經(jīng)過(guò)榨取、精煉等工藝提煉而成,富含不飽和脂肪酸(83%～90%)、亞油酸、磷脂質(zhì)、維生素E、甾醇等物質(zhì),在國(guó)際上被稱(chēng)為營(yíng)養(yǎng)保健油[1]。其本身不含有膽固醇,能夠溶解血液中的膽固醇,避免血液中膽固醇的積累,減少對(duì)血管產(chǎn)生硬化影響；維生素E的存在,使玉米油能夠有效預(yù)防冠狀動(dòng)脈心臟疾病,延緩衰老,在世界范圍內(nèi)備受追捧。然而,在生產(chǎn)加工過(guò)程中,玉米油極易被黃曲霉毒素(Aflatoxin :AFT)侵染。AFT是一種 Ⅰ 類(lèi)致癌物質(zhì),是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物,主要包括黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFTB2)、黃曲霉毒素G1(AFTG1)、黃曲霉毒素G2(AFTG2)、黃曲霉毒素M1(AFTM1)和黃曲霉毒素M2(AFTM2)等,具有高致癌性。長(zhǎng)期食用會(huì)導(dǎo)致人體免疫系統(tǒng)損傷,引起肝臟出血,誘發(fā)癌癥。AFT在傳統(tǒng)的烹飪中難以祛除,對(duì)人類(lèi)健康具有較大的潛在威脅[2]。當(dāng)下AFT的消減主要從三個(gè)方面進(jìn)行:源頭控制,貯藏期預(yù)防控制以及污染后控制。但是,目前AFT的控制技術(shù)還存在一定的缺陷,人為因素影響較大,難以保證對(duì)AFT的處理效果。從AFT在玉米、玉米油中的污染及AFT的危害、檢測(cè)及控制與脫毒方法等方面闡述對(duì)玉米、玉米油中AFT的消減,以期對(duì)國(guó)內(nèi)玉米、玉米油中AFT的消減提供參考,減少糧食浪費(fèi),確保食品安全。

1 玉米及玉米油中AFT的危害侵染情況

1.1 AFT的危害

有文獻(xiàn)記載,AFB1最具毒性和致癌性。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將其歸類(lèi)為人類(lèi)第一類(lèi)致癌物[3]。AFT是由黃曲霉和寄生曲霉所產(chǎn)生的一系列次生代謝產(chǎn)物,已知有多種類(lèi)型,具有較大的毒害作用有四種,即AFB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2。其中,AFB1的毒性最大,最早報(bào)道于1960年的英國(guó),一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就造成了100 000只火雞的死亡。AFT在進(jìn)入人體后,會(huì)阻止細(xì)胞中RNA、DNA和蛋白質(zhì)生物大分子的合成,從而對(duì)人體造成巨大損傷[4]。AFT中毒,有兩種描述形式,一是因短暫接觸大量AFT而引起的“急性中毒”,其特征是嚴(yán)重的肝臟損傷、出血、水腫和最終死亡；二是長(zhǎng)期接觸少量的AFT所形成的“慢性中毒”,使機(jī)體免疫抑制、營(yíng)養(yǎng)失調(diào),嚴(yán)重者還會(huì)產(chǎn)生癌癥。已有研究指出,AFT與慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染有關(guān)[5]。每年由AFB1誘導(dǎo)產(chǎn)生的人類(lèi)肝細(xì)胞癌(HCC)造成的病例全球高達(dá)155 000例。目前,肝癌已成為世界第二大癌癥,在中國(guó)癌癥中占比19.33%。

1.2 玉米及玉米油中AFT的危害侵染情況

玉米是世界上重要的糧食作物和食品、飼料原料,由于生長(zhǎng)環(huán)境、加工和貯藏等因素的影響,極易被霉菌污染,進(jìn)而造成玉米油的污染。蘭靜等[6]報(bào)告,我國(guó)玉米中AFT污染情況與地域的水分含量有關(guān),總體上,南方玉米中AFT的污染情況要高于北方。研究顯示,我國(guó)北方玉米中AFB1檢出率為91.4%,超標(biāo)率為2.8%。南方區(qū)域飼用玉米AFB1檢出率為93.3%,超標(biāo)率高26.6%。高秀芬等[7]在對(duì)中國(guó)部分地區(qū)玉米中4種AFT污染調(diào)查中,收集了279份樣品,發(fā)現(xiàn)其中AFT陽(yáng)性率為75.63%,陽(yáng)性樣品平均濃度為44.04 μg/kg,濃度范圍為0.20～888.30 μg/kg。楊曉倩等[8]采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)2016年山東省90份鮮玉米真菌毒素進(jìn)行監(jiān)測(cè),結(jié)果顯示,AFT檢出率為8.88%。然而,在玉米油中,AFT的超標(biāo)率較低。李昕等[9]在2015年山東部分地區(qū)食用植物油中AFB1污染狀況調(diào)查中指出玉米胚芽油超標(biāo)率為0.00%,張毅[10]、劉輝[11]等報(bào)告也證明了這一點(diǎn),這表明目前玉米油中AFT的消減技術(shù)已經(jīng)形成完善的體系。

圖1 四種常見(jiàn)的黃曲霉素毒素結(jié)構(gòu)式

表1 玉米、玉米油中AFB1污染情況調(diào)查

2 AFT的限量標(biāo)準(zhǔn)

考慮到AFT對(duì)消費(fèi)者健康的潛在危害,許多國(guó)家(地區(qū))和組織都對(duì)食品和飼料中的AFT設(shè)定了最高限量。國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)建議食品中AFT總量應(yīng)保持在15 μg/kg以?xún)?nèi)；美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)規(guī)定,除牛奶外,所有食品中AFT總量的最大可接受限量為20 μg/kg；在歐盟,已經(jīng)制定了更嚴(yán)格的規(guī)定,在花生、干果和谷類(lèi)食品中,供人類(lèi)直接食用或用作配料的AFB1和總AFT的最高允許含量分別為2 μg/kg和4 μg/kg；日本規(guī)定食品中AFT的總量要低于在10 μg/kg；南非法律規(guī)定食品中AFB1+AFB2+AFG1+AFG2≤10 μg/kg,其中,AFB1要低于5 μg/kg；印度、越南等眾多國(guó)家和地區(qū)對(duì)AFT也都制定了限量標(biāo)準(zhǔn)。在中國(guó),法律規(guī)定,供人食用的谷物產(chǎn)品中AFB1的限量范圍為5～10 μg/kg,而動(dòng)物飼料中的允許含量相對(duì)較高,達(dá)到20～50 μg/kg[19]。

表2 我國(guó)食品中AFB1限量指標(biāo) μg/kg

表3 不同地區(qū)玉米(玉米油)中黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn) μg/kg

3 黃曲霉毒素的檢測(cè)方法

國(guó)內(nèi)外學(xué)者有很多對(duì)AFT的檢測(cè)方法,但目前被廣泛應(yīng)用的主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附篩查法(ELISA)和高效液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[20]。

3.1 TLC

TLC是檢測(cè)真菌毒素最經(jīng)典的方法。主要檢測(cè)過(guò)程為樣本提取、柱層析、洗脫、濃縮以及薄層分離等操作,是依據(jù)AFB1的熒光特性與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較從而進(jìn)行定性、定量分析的一種分析方法[21]。在波長(zhǎng)為365 nm的紫外燈照射下,AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2分別呈現(xiàn)出紫色、藍(lán)紫色、綠色、綠色。TLC樣品前處理簡(jiǎn)單、成本低廉,但費(fèi)時(shí)費(fèi)力、靈敏性不強(qiáng),安全性低,目前食品安全工作者已經(jīng)將重點(diǎn)放在精密度和特異性更高的儀器分析方法和免疫分析方法上。

3.2 HPLC

HPLC是目前應(yīng)用比較廣泛,前景比較好的一種AFT檢測(cè)方法。此方法基于AFT在固定性、流動(dòng)性之間的分配量不同實(shí)現(xiàn)分離后,依靠AFTD的熒光特性進(jìn)行檢測(cè)分析。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、分離效率好等優(yōu)點(diǎn),但操作相對(duì)繁瑣,檢出限高[22]。

目前,HPLC法各種食品基質(zhì)中AFT的提取中,在很大程度上,已經(jīng)用甲醇、丙酮或乙腈的水溶液混合物取代以前的一些方法中使用的氯仿提取物,這是國(guó)際上減少氯化溶劑消耗所努力的一部分。而大多數(shù)基質(zhì)的萃取物中含有大量的共萃取雜質(zhì),不適合直接進(jìn)行色譜分析,需要提純。常用的是免疫親和層析柱(IAC)或者多功能進(jìn)化柱(MFC)進(jìn)行分離萃取。樣品在長(zhǎng)波紫外線(xiàn)下進(jìn)行分離,使AFT分離后發(fā)出熒光,可以被熒光檢測(cè)器檢測(cè)并進(jìn)行測(cè)量分析。為了最大化天然AFT熒光并提高方法靈敏度,許多學(xué)者通過(guò)用三氟乙酸進(jìn)行柱前衍生化以及用碘或溴進(jìn)行柱后衍生化將AFT轉(zhuǎn)化為更強(qiáng)的熒光衍生物[23]。

3.3 ELISA

ELISA具有方便、快捷、靈敏、成本低、易規(guī)?；瘧?yīng)用等優(yōu)點(diǎn),能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量樣品完成檢測(cè)。主要原理是利用抗體的特異性,在抗體抗原結(jié)合后,通過(guò)檢測(cè)抗體、抗原或者反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量、定性分析。在這種測(cè)定方法中必須要有3個(gè)基本部分,即結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體(免疫吸附劑)、酶標(biāo)記的抗原或抗體(標(biāo)記物)、酶作用的底物(顯色劑)[24]。分析的依據(jù)是有色產(chǎn)物的量引起的顏色深淺程度。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果抗干擾能力差,易受外來(lái)因素的干擾,出現(xiàn)假陽(yáng)性。

3.4 LC-MS/MS

LC-MS/MS,相比于其他的檢測(cè)技術(shù),準(zhǔn)確度和靈敏度較高,能夠同時(shí)對(duì)多種真菌毒素進(jìn)行測(cè)量[25]。其特點(diǎn)是在高效液相色譜法的基礎(chǔ)上,進(jìn)行質(zhì)譜離子掃描,分析識(shí)別未知黨的分析物,與圖書(shū)館可檢索的電離質(zhì)譜相比較,可以快速、自動(dòng)、合法和可靠地進(jìn)行分子鑒定。缺點(diǎn)是分析成本高,具有進(jìn)行此類(lèi)測(cè)量的技術(shù)和人力資源的實(shí)驗(yàn)室有限。

表4 四種常見(jiàn)AFT檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍

4 玉米(玉米油)加工過(guò)程對(duì)AFT的控制

4.1 玉米原料的篩選與控制

已有文獻(xiàn)表明,玉米的品種、環(huán)境對(duì)AFT的污染有著較大影響[26]。對(duì)玉米抗黃曲霉種質(zhì)進(jìn)行培育,是解決黃曲霉污染最有效的途徑。目前,隨著對(duì)玉米中黃曲霉研究的不斷深入,對(duì)黃曲霉玉米基因的了解也越來(lái)越多。美國(guó)的William等[27]發(fā)明了抗黃曲霉自交系Mp313E、Mp420、Mp715等抗原種質(zhì)。鄧德祥等[28]通過(guò)對(duì)玉米自交系進(jìn)行篩選,得到8個(gè)具有高抗黃曲霉性質(zhì)的品系。

其次,在玉米的選種上,應(yīng)該選擇抗倒伏能力強(qiáng)、顆粒飽滿(mǎn)的品種。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),玉米倒伏后,會(huì)使玉米與土地的接觸面積,玉米的環(huán)境濕度有所增加,更易遭受真菌毒素的污染；環(huán)境的變化,也會(huì)引起玉米中AFT的變化,收獲前期和收獲末期連續(xù)降雨,會(huì)使玉米水分含量升高,從而導(dǎo)致玉米中AFT含量增加。所以玉米在收獲后,必須及時(shí)進(jìn)行晾曬,降低玉米水分含量。

在玉米原料中,破損粒中的AFT含量是正常玉米粒的幾十倍,進(jìn)行篩選,去除已損傷的玉米粒,能有效防止黃曲霉污染的擴(kuò)散。例如,羅小虎等[29]通過(guò)比重篩選機(jī)對(duì)玉米原料進(jìn)行篩選后,重質(zhì)玉米中AFB1的含量相比較于原料玉米,分別降低了21.2%和38.4%。

一些學(xué)者也在研究通過(guò)對(duì)玉米原料進(jìn)行脫毒處理,降低AFT的含量。李笑櫻[30]等人提出用HSCAS(水合鋁硅酸鈉鈣)與AFB1發(fā)生螯合反應(yīng),形成穩(wěn)定的金屬螯合物,吸附大量AFB1；刁恩杰等[31]用臭氧攻擊AFT,干法處理30 h后,脫毒率為82.88%；濕法處理,脫毒率為89.78%；Mendez[32]等提出通過(guò)檸檬酸處理后的玉米,AFT降解率能達(dá)到96.7%。此外,還有紫外線(xiàn)照射脫毒、微生物脫毒等,均對(duì)玉米中的AFT有較好的消減作用。

4.2 貯藏過(guò)程中AFT的控制

玉米屬于不耐儲(chǔ)糧食,在儲(chǔ)藏過(guò)程中極易產(chǎn)生霉菌毒素,被黃曲霉污染,對(duì)糧食安全帶來(lái)很大隱患。Pitt[33]和Magan[34]對(duì)霉菌霉菌產(chǎn)毒條件進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)當(dāng)水分含量低于13%時(shí),大麥中的大部分霉菌都停止了生長(zhǎng)。王紅梅[35]發(fā)現(xiàn)當(dāng)玉米水分含量在15.7%時(shí),貯藏40 d后,玉米中的AFT含量高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；水分含量為14.5%、13.8%時(shí),分別在100 d、170 d達(dá)到限量標(biāo)準(zhǔn)；水分含量為12.4%的玉米中AFT含量一直在檢出限以?xún)?nèi)。戴曉武等[36]通過(guò)調(diào)查表明,在一定范圍內(nèi),霉菌毒素對(duì)玉米的影響隨水分含量的升高而升高。季青躍等[37]通過(guò)高水分玉米儲(chǔ)藏試驗(yàn)說(shuō)明,水分含量在10%～15%之間時(shí),也可以保證糧食質(zhì)量,但成本較高,不適合于常規(guī)貯藏。

儲(chǔ)藏溫度也會(huì)對(duì)霉菌生長(zhǎng)造成較大影響。丁麗等[38]發(fā)現(xiàn)糧食貯藏過(guò)程中,霉菌生長(zhǎng)的最適溫度為25～30 ℃。溫度對(duì)黃曲霉毒素的影響與玉米水分含量息息相關(guān)。有研究表明,玉米在水分含量4.3%～5.0%,溫度50 ℃ 條件下,或者水分含量為5.4%～6.2%,35 ℃ 時(shí),AFT較少,最適貯藏。AFT調(diào)控基因在水分含量15%～30%、溫度27 ℃ 條件下最為活躍,導(dǎo)致高水平AFB1含量的產(chǎn)生。一般玉米的安全貯藏條件為水分含量低于14%,溫度保持在10 ℃以下。

此外,穗貯與粒貯并用是玉米貯藏的一個(gè)突出特點(diǎn),常年相對(duì)濕度高的地區(qū)采用粒藏法；常年相對(duì)濕度較低的地區(qū),例如我國(guó)北方,常采用穗藏法,但后者谷倉(cāng)利用率太低。貯藏方式也可根據(jù)廠房、氣候等條件選擇常規(guī)儲(chǔ)藏、氮?dú)庹{(diào)儲(chǔ)藏或者低溫儲(chǔ)藏。貯藏空間要經(jīng)常通風(fēng)換氣,保證潔凈干燥,防止AFT的再次污染。玉米在儲(chǔ)藏過(guò)程中,AFT含量與儲(chǔ)藏時(shí)間成正相關(guān)關(guān)系,所以需要對(duì)儲(chǔ)藏玉米進(jìn)行輪換以防止糧食變質(zhì)。按照相關(guān)規(guī)定,玉米儲(chǔ)存輪換期為三年。但根據(jù)李蘭芳等[39]的報(bào)告,由于條件限制,剛儲(chǔ)存的玉米脂肪酸含量在40～50 mg KOH/100 g之間,但經(jīng)過(guò)1年儲(chǔ)存后很容易超過(guò)50 mg KOH/100 g,為輕度不適宜,因此大多一年一輪換。

4.3 玉米油生產(chǎn)過(guò)程中AFT的控制

玉米胚芽油的加工工藝大致可分為壓榨、堿煉、脫酸、脫色、脫臭等過(guò)程。有研究表明,玉米胚樣品在經(jīng)過(guò)浸出取油、壓榨去油后,黃曲霉毒素含量的平均值由7.24 μg/kg減少到了0.70、1.59 μg/kg[40]。同一玉米胚,由于AFB1在正己烷溶劑中的溶解度遠(yuǎn)小于在油脂中的溶解度,所以AFB1的含量,浸出毛油要低于壓榨毛油。陳金定等[41]提出在玉米油吸附脫色的精煉過(guò)程中,選用活性白土或凹凸棒石或WY2活性炭、添加量2%、吸附時(shí)間25 min、吸附溫度100 ℃的工藝條件,可將玉米毛油中AFB1含量降至歐盟要求的小于等于2 μg/kg的限量指標(biāo)。劉玉蘭等[42]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)改進(jìn)堿煉法后,對(duì)玉米毛油中AFB1的脫除率達(dá)90%以上,經(jīng)堿煉后玉米毛油中AFB1含量從73.35 μg/kg降至5 μg/kg以下,明顯優(yōu)于GB 2716—2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的小于等于20 μg/kg的限量指標(biāo)。劉玉蘭等[43]還曾在文獻(xiàn)中提出,可以采用優(yōu)化的高溫蒸餾脫除技術(shù)對(duì)油脂中的AFT進(jìn)行處理,脫毒率達(dá)60%。

4.4 玉米油中AFT的消減與控制

目前,玉米油中的AFT消減工藝已經(jīng)比較成熟,經(jīng)過(guò)對(duì)原料貯藏和加工過(guò)程的慎重控制后,一般都會(huì)滿(mǎn)足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[44]。但也可能因?yàn)槟承┮馔庖蛩貙?dǎo)致AFT的污染。目前對(duì)于成品玉米油,最常用的是AFT消減方法是吸附法和輻射處理法。Sun等[45]發(fā)現(xiàn)磁性GO(氧化石墨烯)的摻雜有效地提高了TiO2在紫外光和可見(jiàn)光下的光催化活性,在紫外可見(jiàn)光下光照120 min后,玉米油中AFB1的降解率可達(dá)96.4%。Shen[46]曾在文獻(xiàn)中提到,臭氧處理結(jié)合紫外線(xiàn)輻射可以顯著提高AFT的降解率。Alam等[47]通過(guò)AFT與蒙脫石相互作用的研究證明,鈣蒙脫石在水中對(duì)AFB1的吸附量高達(dá)0.6 mol/kg。此外,根據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究報(bào)道,活性白土、凹凸棒石、WY1 活性炭、WY2 活性炭以及HSCAS(水合鋁硅酸鈉鈣)、海泡石(SepSp-1)等物質(zhì)對(duì)AFT也有著較好地吸附作用。

表5 玉米、玉米油中黃曲霉毒素的常見(jiàn)控制方法 %

5 展 望

目前,對(duì)于玉米中AFT的檢測(cè)方法多種多樣,對(duì)玉米油中AFT的控制更是有了一套相對(duì)成熟的體系。然而,針對(duì)其它食品中的真菌毒素污染,例如花生油中AFT的控制,還需要進(jìn)一步完善檢測(cè)方法、了解真菌毒素的作用機(jī)理,在考慮實(shí)際生產(chǎn),大規(guī)模應(yīng)用的基礎(chǔ)上,探索脫毒方法,進(jìn)一步明確真菌毒素降解產(chǎn)物的安全性。本文旨在為后來(lái)學(xué)者、專(zhuān)家提供參考,以創(chuàng)造出更加簡(jiǎn)捷、高效的檢測(cè)方法,更加完善的加工與脫毒體系,共筑食品安全長(zhǎng)墻。