楊曉光

摘 要 以胡桃楸的成熟合子胚為外植體，采用不同消毒方式和培養(yǎng)方式進行組織培養(yǎng)研究，分析了污染率和愈傷組織誘導(dǎo)率。結(jié)果表明：紫外線直射15 min滅菌效果最好，污染率及褐化率均最低，分別為15.82%和22.93%;暗培養(yǎng)時間長利于愈傷組織的誘導(dǎo)，以15 d左右為佳。

關(guān)鍵詞 胡桃楸;外植體;誘導(dǎo);愈傷組織

中圖分類號：S723.1 文獻標(biāo)識碼：A doi：10.13601/j.issn.1005-5215.2021.05.013

Abstract Taking mature zygotic embryos of Juglans mandshurica as explants，using different disinfection methods and culture methods for tissue culture research，and the pollution rate and induction of callus were analyzed.Result shows that the sterilization effect of direct ultraviolet radiation for 15 minutes is the optimal，and the pollution rate and browning rate are the lowest，which are 15.82% & 22.93%;the dark culture time is optimal for the induction of callus，preferably around 15 d.

Key words Juglans mandshurica;explants;induction;callus

胡桃楸（Juglans mandshurica）屬胡桃科胡桃屬的落葉喬木，在我國北方地區(qū)是一類果材兼具用珍貴樹種，果實具有很高的食用價值，營養(yǎng)豐富，根莖葉有很高的藥用價值，木材性狀優(yōu)良，在家具等行業(yè)也得到廣泛應(yīng)用。由此可知胡桃楸的栽植應(yīng)用前景廣闊。胡桃楸傳統(tǒng)育苗方式主要采取播種繁殖，其種子具有深度休眠的特性，此種繁殖方法存在需要對休眠的種子進行處理且后代無法持續(xù)地將母樹優(yōu)良性狀保存下來等問題，因此，發(fā)展無性繁殖方式優(yōu)越性更加明顯。

目前，胡桃楸無性繁殖方式中采取的主要方式是組織培養(yǎng)、扦插等，學(xué)者對胡桃楸的扦插[1，2]、組織培養(yǎng)[3，4]方面開展了一系列的研究，相對來說組織培養(yǎng)的優(yōu)勢更加明顯，需要的空間小，不受到時間的限制，具有較大的擴繁系數(shù)，因此，本研究選擇組織培養(yǎng)的方法，外植體選擇成熟的合子胚，經(jīng)過消毒、培養(yǎng)預(yù)處理后進行不定芽萌發(fā)效果的研究，為胡桃楸不定芽誘導(dǎo)植株再生體系的建立、實現(xiàn)育種技術(shù)的改良等方面提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗所需種子采集于遼寧省凌源市青龍河國家自然保護區(qū)，地理坐標(biāo)為18°51′58″—119°09′39″ E，40°46′21″—40°53′02″ N，處于凌源市的燕山東段暖溫帶北緣。保護區(qū)主要保護人參、紫椴、黃檗、野大豆等珍稀瀕危野生植物及其生境，保護天然側(cè)柏林、天然胡桃楸、天然蒙古櫟林等典型的原生植被和黑鸛、東方白鸛、金雕、大鴇等珍稀瀕危野生動物及其棲息地。

青龍河保護區(qū)內(nèi)胡桃楸天然林面積較大，采集保護區(qū)內(nèi)胡桃楸優(yōu)良母樹種子，經(jīng)過晾曬、外皮清理后放在干燥、通風(fēng)、溫度20～25 ℃條件下備用。在接種前敲碎外殼，將種子尖部的合子胚（帶子葉少量）取出作為外植體用于不定芽的誘導(dǎo)試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒預(yù)處理試驗

外植體消毒試驗共設(shè)6個預(yù)處理，分別為：0.2%氯化汞溶液處理5 min、10 min;2%次氯酸鈉溶液處理10 min、15 min;紫外線直射10 min、15 min。預(yù)處理前先取合子胚置于75%酒精溶液中，30 min后撈出按照不同的預(yù)處理方案實施消毒處理，用無菌水沖洗4～5遍，最后在培養(yǎng)基上接種。所選擇的培養(yǎng)基為改良版的DKW空白培養(yǎng)基，其中每L培養(yǎng)基中另外添加了瓊脂6 g、蔗糖30 g，pH控制在5.8左右。6個處理均設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)內(nèi)有外植體8個。接種后2周進行污染率、褐化率調(diào)查統(tǒng)計。

1.2.2 外植體培養(yǎng)方法預(yù)處理試驗

試驗中外植體經(jīng)過消毒后（選擇1.2.1試驗中效果最好的消毒預(yù)處理方式），轉(zhuǎn)移到暗環(huán)境中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)時間共設(shè)6個處理，分別為暗培養(yǎng)3、6、9、12、15、18 d。培養(yǎng)基選擇改良后的DKW培養(yǎng)基（每L培養(yǎng)基中另外添加了蔗糖30 g、瓊脂6 g、6-BA 2.0 mg、吲哚乙酸0.01 mg，pH控制在5.8左右），對不同暗培養(yǎng)時間愈傷誘導(dǎo)率進行調(diào)查。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)內(nèi)安排10個外植體。

按照不同時間處理后，將外植體接種到改良的DKW培養(yǎng)基上進行光培養(yǎng)，在控制溫度25 ℃、光照強度1 500 lx、光照周期為14 h光照10 h黑暗的條件下培養(yǎng)。對培養(yǎng)后不定芽誘導(dǎo)情況進行統(tǒng)計分析。

1.3 調(diào)查統(tǒng)計方法

利用Excel、DPS進行數(shù)據(jù)處理。愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=外植體中產(chǎn)生愈傷組織的個數(shù)/外植體接種總個數(shù)×100;不定芽誘導(dǎo)率（%）=外植體中產(chǎn)生不定芽的個數(shù)/外植體接種總個數(shù)×100。各處理取3次重復(fù)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒預(yù)處理方法對胡桃楸外植體消毒效果的影響

植物外植體消毒處理的效果直接影響后期組織培養(yǎng)的效果。本試驗不同消毒預(yù)處理方法胡桃楸外植體污染率及褐化率見表1。根據(jù)表1可知，選擇胡桃楸的成熟胚作為外植體，消毒預(yù)處理的方法不同，污染率及褐化率表現(xiàn)也不同：0.2%氯化汞溶液處理5 min的污染率最高，達到70.23%，極顯著高于其他處理;其次是2%次氯酸鈉溶液處理10 min，污染率為47.28%，與0.2%氯化汞溶液處理10 min、2%次氯酸鈉溶液處理15 min的2個處理差異不顯著，但極顯著高于紫外線直射的2個處理;紫外線處理的污染率最低，且隨著直射時間的延長，污染率極顯著降低。根據(jù)表1可知，褐化率以0.2%氯化汞溶液處理10 min最高，達到62.12%，極顯著高于其他處理;其次是2%次氯酸鈉溶液的2個處理，但這2個處理之間差異不顯著;以紫外線直射的褐化率最低，為20%以下，且直射時間越長，褐化率越低。

2.2 不同培養(yǎng)預(yù)處理方法對胡桃楸外植體愈傷誘導(dǎo)率及不定芽誘導(dǎo)效果的影響

胡桃楸成熟胚經(jīng)過消毒預(yù)處理后，暗培養(yǎng)的時間不同，外植體愈傷誘導(dǎo)率、不定芽誘導(dǎo)率表現(xiàn)出不同程度的差異，結(jié)果見表2。根據(jù)表2可知，隨著暗培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織的誘導(dǎo)率逐漸增加，暗培養(yǎng)時間在12 d以內(nèi)時，隨著時間的延長誘導(dǎo)率明顯增加，超過12 d后誘導(dǎo)率雖然有所增加，但是增加趨勢不明顯;在暗培養(yǎng)時間15 d以內(nèi)時，外植體不定芽誘導(dǎo)率逐漸增加，15 d時達到最大，為36.8%，與暗培養(yǎng)12 d的處理差異顯著，這2個處理極顯著高于其他處理，超過15 d后，隨著暗培養(yǎng)時間的延長，不定芽誘導(dǎo)率有所降低。

3 結(jié)論與討論

在植物的組織培養(yǎng)中，外植體的預(yù)處理對培養(yǎng)的效果影響較大，目前在花楸[5]、非洲菊[6]等植物的組織培養(yǎng)中均有相關(guān)報道。預(yù)處理的方式多樣，包括低溫處理、暗培養(yǎng)、滲透壓條件的改變[7]等。本試驗以胡桃楸成熟的合子胚作為外植體開展研究，分析比較了不同消毒預(yù)處理方式、暗培養(yǎng)不同時間處理對胡桃楸外植體的污染率、愈傷組織誘導(dǎo)率、不定芽誘導(dǎo)率的差異，結(jié)果表明，紫外線直射的滅菌效果最好、污染率最低、褐化率最低，顯著或極顯著低于其他處理，這一結(jié)果與趙麗蒙等[8]學(xué)者的研究結(jié)論一致;隨著暗培養(yǎng)時間的延長，胡桃楸外植體愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸增加，先以極顯著的差異增加，而后增加趨勢減緩，差異不顯著;不定芽誘導(dǎo)率變化趨勢表現(xiàn)為先增加后降低，在暗培養(yǎng)15 d時達到最大值，為36.8%。

參考文獻：

[1] 葛文志，劉忠玲，張海峰，等.胡桃楸嫩枝扦插繁殖影響因子研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，133（2）：8-12

[2] 葛文志，劉建明，李業(yè)娟，等.胡桃楸嫩枝扦插技術(shù)及營養(yǎng)物質(zhì)含量變化研究[J].森林工程，2011，32（5）：13-15

[3] 王楊洋，于海洋.核桃楸組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].防護林科技，2017（12）：13-14

[4] 張建瑛，邢亞娟，白卉，等.胡桃楸最佳初代組織培養(yǎng)選擇的研究[J].林業(yè)科技，2011，36（6）：5-6

[5] 沈海龍，高翔翔，楊玲.甘露醇、蔗糖和低溫預(yù)處理對花楸體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響[J].植物生理學(xué)報，2008，44（4）：677-681

[6] 單芹麗，李紳崇，王繼華，等.基因型和預(yù)處理對非洲菊胚珠離體培養(yǎng)的影響[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，27（7）：44-47

[7] 高振宇，黃大年.影響秈稻愈傷組織形成和植株再生能力的因素[J].植物生理學(xué)通訊，1999，35（3）：227-230

[8] 趙麗蒙，陸秀君，張麗杰，等.衛(wèi)矛莖段組織培養(yǎng)中消毒方法及不定芽誘導(dǎo)[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，44（12）：21-25