張 茜， 張 丹， 周 楠， 賴曉蕊， 徐境一， 李嘉寶， 王 鑫， 楊 蕾

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 營養(yǎng)科，遼寧 沈陽 110016

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的增殖與凋亡在動脈粥樣硬化等一系列心血管疾病中起關鍵作用，血管重塑是其最主要的機制之一，主要來源于血管損傷后VSMC的增殖和凋亡水平異常[1]。細胞增殖和凋亡涉及多種細胞內信號分子。有研究報道，鞘磷脂在心肌梗死、高血壓、中風、2型糖尿病和肥胖癥等多種疾病的發(fā)病機制中起著關鍵作用[2-3]。鞘磷脂是細胞膜的生物活性成分，也是細胞信號轉導的重要因子，參與細胞增殖、成熟和凋亡等多個過程。常見的鞘磷脂家族包括神經酰胺、鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)，均已經被證明在細胞中發(fā)揮重要的結構和調節(jié)作用[4]。近年來，神經酰胺和S1P已成為許多研究的靶點。S1P是一種神經酰胺衍生物，具有抗炎和促有絲分裂的功能，在心臟保護中起重要作用。S1P調節(jié)多種生理過程，包括免疫監(jiān)視、免疫細胞轉運、血管發(fā)育、細胞存活、血管生成、細胞分化和胚胎神經發(fā)生，并被證明參與類固醇合成的調節(jié)[5]。S1P是控制細胞存活、炎癥和細胞遷移的關鍵代謝產物。在血液中觀察到高水平的S1P，特別是在高密度脂蛋白和紅細胞中[6]。在心血管系統內，S1P介導各種活動，包括缺血/再灌注損傷后的心肌保護、改善內皮功能、緩解氧化應激和抗血栓[7]?；颊邅碓吹膬绕ぜ毎诤笾毖男∈竽Ｐ椭酗@示新生血管能力顯著受損，在靜脈輸注前用S1P預處理2 h后，患者來源的內皮細胞顯著促進了缺血后肢的血流恢復[8]。但關于S1P對VSMC的作用機制尚未闡明。本研究初步檢測了大鼠VSMCS1P受體的表達情況，并探討了S1P對大鼠VSMC增殖和凋亡的影響?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物：雄性Wistar大鼠10只，體質量120～160 g，由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物中心提供。青霉素-鏈霉素購自Solarbio公司；DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清購自康寧公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；Trizol裂解液購自日本Takara公司；所有一抗均購自Abcam公司；電化學發(fā)光檢測試劑盒購自Millipore公司；S1P購自Sigma公司；胰蛋白酶購自Gibco公司。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠VSMC分離和培養(yǎng) 頸椎脫臼處死大鼠，無菌條件下打開胸腔，分離胸腹主動脈并放入盛有無菌PBS的細胞培養(yǎng)皿中，用鑷子輕輕剝離血管外結締組織，放入另一盛有無菌PBS的培養(yǎng)皿中。用眼科剪沿縱軸剪開血管條，無菌鑷輕輕刮除內膜，放入含20% FBS的高糖培養(yǎng)基中。用眼科剪剪碎血管條，使組織塊大小約1 mm×1 mm×1 mm，用無菌滴管將組織塊吸入細胞培養(yǎng)瓶，使其均勻貼壁，間距0.2～0.5 cm。向瓶內注入適量培養(yǎng)液，于37℃孵箱內直立放置4～5 h后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉平放，此后每3 d換液1次，生長至3～8代用于實驗研究。

1.2.2 大鼠VSMC鑒定 在24孔板中鋪片，接種大鼠VSMC，待細胞融合度約為60%～70%時棄去培養(yǎng)基，PBS清洗玻片，4%多聚甲醛固定，0.1% TritonX-100破膜，5% BSA封閉，加入工作濃度的抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體，孵育過夜；PBS洗3次，加入工作濃度的熒光二抗，室溫避光孵育45 min，PBS沖洗后染DAPI，熒光顯微鏡下觀察結果并拍照。

1.2.3 實驗分組及處理 大鼠VSMC以每孔1×106個細胞的密度接種于6孔板中，每孔2 ml。細胞分組：對照組、S1P 20 nmol/L組、S1P 100 nmol/L組、S1P 500 nmol/L組、S1P 2 500 nmol/L組及S1P 12 500 nmol/L組，每組設2個復孔，實驗各組加入S1P培養(yǎng)24 h，然后進行后續(xù)實驗。以400 μM濃度的H2O2誘導凋亡。

1.2.4 四甲基偶氮唑鹽法測定細胞活性 將細胞以1×103個/cm2的密度接種于96孔板中，邊緣孔用無菌的PBS填充，每孔加入20 μl四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide，MTT)溶液，在細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后去除培養(yǎng)基，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，待結晶充分溶解后，用微板分光光度計測定490 nm處的光密度值，計算細胞存活率。

1.2.5 原位末端標記法檢測細胞凋亡 PBS洗滌細胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗后0.3% Triton X-100室溫孵育5 min；按照TdT酶：熒光標記液以5∶45的比例配制原位末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL)檢測液，PBS洗滌后加檢測液，避光孵育1 h；PBS洗3次，DAPI孵育5 min復染細胞核，PBS清洗后使用防猝滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并攝片。

1.2.6 Western blot 細胞離心后加入裂解液，冰上裂解后再次離心，采用BCA法測定蛋白濃度。根據樣本濃度加入Loading buffer制備蛋白樣本，進行蛋白電泳。一抗?jié)舛确謩e為Bax抗體(1∶500)、Bcl-2抗體(1∶1 000)、cleave-caspase-3 抗體(1∶500)、cleaved caspase-3抗體(1∶1 000)及β-actin抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜。PBST洗膜，HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫孵育60 min，滴加電化學發(fā)光液顯影，采用Tanon凝膠成像系統采集蛋白表達信號，并用ImageJ軟件分析蛋白條帶強度。

1.2.7 RT-PCR 逆轉錄聚合酶鏈反應按照TRIzol試劑說明書的步驟進行，引物序列如下：S1P受體(S1P receptor，S1PR)1，F：AACTTTGCGAGTGAGCTGGT，R：CTAGAGGGCGAGGTTGAGTG；S1PR2，F：ATAGACCGAGCACAGCCAAC，R：GAGGTGGTCTCCTGCATGTC；S1PR3，F：AAGCCTAGCGGGAGAGAAAC，R：TCAGGGAACAATTGGGAGAG；S1PR4，F：GGACTTCTCGGTCACTCAGC，R：GGCTTGCTGTCATGTTCTCA；S1PR5，F：GGAGGGACTCTCCTGGATTC，R：TTCCTCTGTAGCCAGCCACT。PCR反應條件：95℃ 2 min，60℃ 30 s，72℃ 40 s，共40個循環(huán)，72℃ 10 min，檢測大鼠VSMC中S1P受體的表達。

2 結果

2.1 原代細胞鑒定 大鼠VSMC的主要分子標志為α-SMA，利用細胞免疫熒光法檢測大鼠VSMC中α-SMA的表達情況，結果顯示，提取的原代大鼠平滑肌細胞上α-SMA蛋白呈高表達。見圖1。

圖1 大鼠VSMC免疫熒光化染色結果(a.α-SMA抗體染色；b.DAPI)

2.2 MTT檢測S1P對大鼠VSMC增殖的影響 不同濃度的S1P處理組與對照組比較，S1P濃度<500 nmol/L對細胞的增殖活性無明顯的抑制作用，反而有一些促進作用，但差異無統計學意義(P>0.05)；在S1P 500 nmol/L時，細胞增殖活性達到最高，而S1P濃度在2 500 nmol/L和 12 500 nmol/L對細胞的增殖活性存在一定的抑制作用，差異有統計學意義(P<0.05)。因此，本研究采用的S1P濃度為 500 nmol/L，后續(xù)研究不會受到 S1P濃度的影響。見圖2。

圖2 MTT法檢測加藥S1P對大鼠VSMC增殖的影響

2.3 S1P受體的表達情況 S1P按500 nmol/L濃度加藥處理細胞24 h后，收集細胞進行RNA提取、cDNA反轉錄和RT-PCR檢測S1P受體基因的表達情況。大鼠VSMC主要表達受體S1PR1、S1PR2、SIPR3，而S1PR4和S1PR5表達量很低。S1PR2的基因表達量最高，而S1PR1基因表達量相對較少。見圖3。

圖3 RT-PCR檢測大鼠VSMC受體表達情況

2.4 TUNEL染色檢測S1P對大鼠VSMC凋亡的影響 TUNEL染色結果顯示，400 μM的H2O2溶液能明顯誘導VSMC凋亡。與H2O2處理組比較，在H2O2+S1P處理組中，TUNEL染色陽性率明顯下降，提示S1P可減弱大鼠VSMC中凋亡水平。見圖4。

圖4 TUNEL檢測S1P對大鼠VSMC凋亡的影響(a.H2O2處理組;b.H2O2+S1P處理組)

2.5 Western blot檢測S1P對大鼠VSMC增殖及凋亡水平的影響 以PCNA蛋白表達情況觀察S1P對大鼠VSMC增殖的影響，結果發(fā)現，S1P處理后PCNA的表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示S1P可提高大鼠VSMC的增殖能力。見圖5。以Bax及Bcl-2蛋白比值和cleave-caspase-3及總caspase-3蛋白比值的變化觀察S1P對大鼠VSMC凋亡水平的影響，結果發(fā)現，與對照組比較，S1P處理后的大鼠VSMC中Bax與Bcl-2的比值明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；cleave-caspase-3與caspase-3總蛋白的比值也顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)；提示S1P可抑制大鼠VSMC的凋亡水平。見圖6。

圖5 Western blot檢測加藥S1P對大鼠VSMC增殖的影響

圖6 Western blot檢測加藥S1P對大鼠VSMC凋亡的影響

3 討論

由高血壓、高血糖和高脂血癥引起的心血管疾病是全球死亡的主要原因之一。VSMC不僅是血管的主要組成成分，也是動脈粥樣硬化斑塊的主要細胞成分[9]，受血流施加的恒定機械應力的影響。因此，VSMC的增殖、凋亡、遷移、炎癥、分化和表型改變與血管重構和動脈粥樣硬化等疾病密切相關[10]。然而，引起VSMC病理生理表現的機械力的潛在機制仍不清楚。

鞘磷脂代謝產物神經酰胺、S1P和神經酰胺磷酸鹽是調節(jié)細胞增殖、存活、胚胎發(fā)育、器官發(fā)生或免疫細胞運輸等關鍵生理功能的主要信號分子，并參與多種病理過程。S1P是一種有生物活性的鞘磷脂，在不同的器官系統中調節(jié)著不同的生理功能。S1P具有5種特異性的細胞表面G蛋白偶聯受體(S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5)，在心血管系統中的作用多種多樣，這取決于其產生的細胞類型。S1P對單核細胞的粘附和遷移以及平滑肌細胞的細胞活力有不同的影響，這對動脈粥樣硬化的發(fā)展至關重要[11]。S1P、S1P受體、Src激酶、CXCR4受體介導的信號對于內皮祖細胞歸巢和功能整合到缺血組織是必不可少的[12]。Lee等[13]研究發(fā)現，FTY720的S1P受體激動劑促進基質細胞衍生因子-1誘導的人CD34+祖細胞遷移和骨髓歸巢。有研究報道，S1P通過rac1和Cdc42信號通路恢復骨髓來源的祖細胞誘導的內皮屏障保護功能[14]。此外，S1P可抑制白細胞與內皮細胞的粘附和隨后的遷移，以及內皮細胞中促炎介質的產生。S1P通過S1PR3/PDGFR-β/AKT信號通路誘導內皮祖細胞遷移和血管生成[12]。

VSMC是構成血管壁的主要細胞，心血管疾病(包括高血壓、動脈硬化和血管狹窄)與VSMC功能障礙密切相關[15-16]。本研究結果表明，一定濃度的S1P可使VSMC PCNA蛋白表達水平升高，Bax/Bcl-2水平下降。PCNA是一種與細胞增殖相關的蛋白質，可促進DNA損傷耐受，減少細胞凋亡。Bcl-2家族參與細胞凋亡，Bcl-2蛋白為抗凋亡標志物，Bax為促凋亡標志物，Bcl-2/Bax平衡失調可誘導VSMC發(fā)生凋亡，參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。VSMC增殖和凋亡是心血管發(fā)生病變的主要病理基礎。本研究結果顯示，適量S1P可促進大鼠VSMC增殖，抑制凋亡發(fā)生，為 S1P可作為干預靶點治療以 VSMC為發(fā)病核心環(huán)節(jié)的心血管疾病提供新的思路和實驗基礎。但由于S1P具有5種特異性細胞表面受體，了解具體哪種受體在改善VSMC的生物學特性中起重要作用還有待進一步研究。

綜上所述，S1P信號是眾多促血管生長因子的一種重要信號轉導分子，可被看作是一種脂類促血管生長因子，在調節(jié)血管生成中發(fā)揮重要作用。一定濃度的S1P可使VSMC增殖水平升高，凋亡水平下降。