王 艷, 鄒會(huì)玲, 剛 強(qiáng), 孫 宇

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院/南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)宿遷醫(yī)院,1. 老年醫(yī)學(xué)科, 2. 內(nèi)分泌科, 江蘇 宿遷, 223800)

2型糖尿病(T2DM)是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝疾病，中國(guó)T2DM患病率已高達(dá)11.6%, 且發(fā)病率仍呈持續(xù)增高趨勢(shì)[1]。T2DM已被證實(shí)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)的影響因素[2]。急性心肌梗死(AMI)是CHD最危重的類(lèi)型，患者病死率高，整體預(yù)后差。與非糖尿病患者相比, T2DM合并AMI患者的發(fā)病年齡較小，癥狀不典型，冠狀動(dòng)脈病變更加嚴(yán)重，預(yù)后更差。快速、準(zhǔn)確地診斷AMI并予以有效的治療對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要[3]。目前，心肌損傷標(biāo)志物中以心肌肌鈣蛋白(cTn)的敏感性和特異性最高，胸痛發(fā)作4～12 h即可在血清中檢測(cè)到cTn水平升高，但在AMI發(fā)病的早期仍不夠敏感; 同時(shí), cTn在終末期腎功能衰竭、心力衰竭、快速心律失常等疾病患者中亦可升高[4-5]。因此，臨床上迫切需要尋找一種在T2DM合并AMI時(shí)變化更早、敏感性和特異性更高的新型生物學(xué)標(biāo)志物[6]。微小核糖核酸(miRNA)是非編碼小分子RNA中的一種，研究[7-8]證實(shí)外周血中miRNA不僅存在穩(wěn)定，而且隨疾病類(lèi)型改變和持續(xù)時(shí)間變化出現(xiàn)表達(dá)種類(lèi)和表達(dá)量的改變。作者的前期研究[9]發(fā)現(xiàn)miRNA-93可以作為糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期診斷標(biāo)志物，表明miRNA-93參與AMI心肌損傷過(guò)程，可能在AMI發(fā)病早期即發(fā)生表達(dá)改變。本研究探討miRNA-93在T2DM合并AMI患者中的表達(dá)水平，評(píng)估其在T2DM合并AMI中的早期診斷價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入2018年10月—2021年1月因胸痛在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院心血管內(nèi)科住院治療的T2DM患者147例，所有患者均在發(fā)病6 h內(nèi)到達(dá)醫(yī)院，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影后明確診斷為AMI, 分為AMI組76例和非AMI組71例(包括穩(wěn)定型心絞痛、心力衰竭、主動(dòng)脈夾層、反流性食管炎等)，年齡37～92歲，平均(56.7±11.1)歲。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 年齡≥18歲者; ② 病歷資料數(shù)據(jù)齊全者; ③ 簽署知情同意書(shū)者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 嚴(yán)重的肝腎功能衰竭、惡性腫瘤、嚴(yán)重感染、合并自身免疫性疾病者; ② 近期有冠狀動(dòng)脈溶栓、支架植入或搭橋病史者。本研究獲得徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)相關(guān)指南[10-11]的AMI診斷標(biāo)準(zhǔn), cTn至少1次超過(guò)正常參考值上限，同時(shí)有急性心肌缺血的臨床證據(jù): ① 急性心肌缺血癥狀; ② 新的缺血性心電圖改變;③ 新發(fā)病理性Q波; ④ 新的存活心肌丟失或室壁節(jié)段運(yùn)動(dòng)異常的影像學(xué)證據(jù); ⑤ 冠狀動(dòng)脈造影或腔內(nèi)影像學(xué)檢查證實(shí)冠狀動(dòng)脈血栓。T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中國(guó)2型糖尿病防治指南: ① 具有典型糖尿病癥狀(口干、多飲、多尿、伴體質(zhì)量下降)且隨機(jī)靜脈血糖≥11.1 mmol/L; ② 空腹血糖(FBG)≥7.0 mmol/L; ③ 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)結(jié)果顯示葡萄糖負(fù)荷后2 h血糖≥ 11.1 mmol/L。

1.2 研究方法

采用電化學(xué)發(fā)光儀(Beckmall Coulter, 美國(guó))檢測(cè)所有患者發(fā)病6 h內(nèi)的心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌紅蛋白(Mb)水平。采用全自動(dòng)生化免疫分析儀測(cè)定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.3 血清miRNA-93檢測(cè)

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)儀(ABI, 美國(guó), 7500)自帶分析軟件檢測(cè)所有入組患者發(fā)病6 h內(nèi)血清miRNA-93水平。該qPCR為加尾法，以u(píng)6為內(nèi)參，采用miRNeasy血清血漿純化試劑盒(Qiagen, 德國(guó)，應(yīng)用生物系統(tǒng))進(jìn)行小RNA提取，按試劑盒說(shuō)明書(shū)(Qiagen, 德國(guó))提取血漿總核糖核酸300 μL, 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)(Qiagen, 德國(guó))合成cDNA。使用Premier Primer 5.0軟件，根據(jù)GenBank和miRBase中公布的基因序列設(shè)計(jì)引物。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，記錄每孔的CT值，以3個(gè)復(fù)孔的平均值作為最終結(jié)果。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 2組患者基線資料比較

2組男性比率、吸煙史、高血壓史、LDL-C、cTnI、miRNA-93比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組患者臨床資料比較

2.2 MiRNA-93對(duì)AMI的早期診斷價(jià)值

應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線分析miRNA-93、cTnI對(duì)AMI的早期診斷價(jià)值，結(jié)果顯示, miRNA-93預(yù)測(cè)AMI的曲線下面積(AUC)為0.884，高于cTnI的AUC 0.786, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 提示miRNA-93具有良好的敏感性和特異性。見(jiàn)表3。

表3 MiRNA-93、cTnI對(duì)AMI的診斷價(jià)值

2.3 AMI發(fā)生的危險(xiǎn)因素

以是否發(fā)生AMI為因變量，以性別、吸煙史、高血壓病史及LDL-C為自變量，結(jié)果顯示, miRNA-93和吸煙史分別是AMI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=3.285、1.864,P均<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 AMI發(fā)生的危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

3 討 論

心血管事件是T2DM患者最重要的終點(diǎn)事件，也是T2DM患者死亡的最常見(jiàn)原因，其中AMI的死亡率最高[12]。合并T2DM的AMI患者或可合并其他多種糖尿病慢性并發(fā)癥，其發(fā)病早期可能出現(xiàn)癥狀不典型，甚至無(wú)痛性AMI, 且cTnI也可能因其他合并癥導(dǎo)致敏感性和特異性下降，對(duì)T2DM合并AMI患者的早期精準(zhǔn)診斷提出了挑戰(zhàn)，臨床上急需一種在T2DM患者AMI發(fā)病時(shí)變化更快、敏感性和特異性更高的新型生物學(xué)標(biāo)志物。MiRNA因其獨(dú)特的表達(dá)方式和代謝特點(diǎn)，已成為多種疾病早期診斷的生物標(biāo)志物，作者的前期研究[13]發(fā)現(xiàn)miRNA-93可以作為糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)的早期診斷標(biāo)志物，表明miRNA-93參與AMI的發(fā)病過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者中，合并AMI的患者miRNA-93表達(dá)顯著高于非AMI患者; ROC曲線顯示，與cTnI相比, miRNA-93對(duì)T2DM合并AMI患者具有良好的早期診斷價(jià)值; 多因素Logistic回歸分析顯示, miRNA-93是T2DM發(fā)生AMI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

近年來(lái)研究[14]發(fā)現(xiàn), miRNA參與了生物體內(nèi)復(fù)雜的生理過(guò)程，并與多種人類(lèi)疾病如糖尿病、心血管疾病和癌癥等密切相關(guān)。MiRNA是非編碼小分子RNA 中的一種，其長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，通過(guò)促進(jìn)靶基因的降解或者抑制翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。研究[15]已經(jīng)證實(shí)，外周血中miRNA不但可以穩(wěn)定存在，而且隨疾病類(lèi)型和持續(xù)時(shí)間而出現(xiàn)表達(dá)種類(lèi)和表達(dá)量的改變; 同時(shí), miRNA還表現(xiàn)出了極強(qiáng)的穩(wěn)定性和抗降解能力，在多種疾病的早期診斷中展示出良好的潛力。AMI為CHD最危重的類(lèi)型，若同時(shí)合并T2DM則死亡率明顯升高，且由于臨床表現(xiàn)的不典型，目前的診斷方法存在一定的局限性。目前，外周血miRNA在T2DM中的作用已有報(bào)道，另有研究者提出外周血miRNA可以作為CHD的診斷標(biāo)志物，但研究結(jié)果并不一致，這可能是由于miRNA在不同類(lèi)型CHD, 甚至發(fā)病不同時(shí)期的表達(dá)也不一致，例如穩(wěn)定型和不穩(wěn)定型心絞痛患者的miRNA表達(dá)譜就具有顯著差異[16-17]。在T2DM合并AMI的早期診斷方面，尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

本課題組長(zhǎng)期聚焦于miRNA對(duì)T2DM慢性并發(fā)癥的早期診斷價(jià)值，前期研究發(fā)現(xiàn)miRNA-93可作為糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)的早期診斷生物標(biāo)志物。在人群研究中, ZHONG Z等[18]發(fā)現(xiàn)miRNA-93在AMI患者中表達(dá)同樣呈上調(diào)表現(xiàn)，提示miRNA-93可能參與AMI發(fā)病; 在基礎(chǔ)研究方面, LIU J W等[19]明確了miRNA-93參與了心肌損傷過(guò)程。SOHRABIFAR N等[20]進(jìn)一步區(qū)分了冠心病患者中是否合并T2DM, 發(fā)現(xiàn)在冠心病合并T2DM患者中, miRNA-93的表達(dá)升高，提示miRNA-93可能共同參與了T2DM和冠心病的重要病理生理過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，與非AMI患者相比, AMI患者中血清miRNA-93水平明顯升高，與cTn相比, miRNA-93對(duì)T2DM合并AMI患者具有更好的早期診斷價(jià)值。本研究進(jìn)一步對(duì)發(fā)生AMI的危險(xiǎn)因素行Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-93是AMI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示miRNA-93可能促進(jìn)了T2DM合并AMI患者重要的病理生理過(guò)程。

本研究尚存在一定的局限性: ① 本項(xiàng)目為病例對(duì)照研究，有可能導(dǎo)致納入人群的選擇存在偏倚; ② 由于受研究時(shí)間限制，本研究納入的樣本量較小，可能導(dǎo)致miRNA-93對(duì)T2DM合并AMI患者的早期診斷價(jià)值產(chǎn)生一定的差異，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量并進(jìn)行前瞻性的隊(duì)列試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在T2DM合并AMI患者中, miRNA-93可作為一個(gè)良好的早期診斷生物標(biāo)志物，能夠識(shí)別一些早期臨床表現(xiàn)不典型患者，避免臨床漏診而導(dǎo)致不良后果。