劉 永，李烈秋，李曉帆

（肇慶學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶 526061）

0 引言

楊梅為我國南方特色水果，主要產(chǎn)自江蘇、浙江、福建、廣東等省份。成熟楊梅果實(shí)色澤鮮艷、酸甜可口、營養(yǎng)豐富、風(fēng)味濃郁［1］，具有開胃生津、消食解暑、排毒養(yǎng)顏、益腎利尿等功效［2］。楊梅富含有機(jī)酸、維生素、花色苷和多酚等活性物質(zhì)，具有抗菌、抗炎、抗氧化、降低血脂等作用［3］。楊梅成熟期正值高溫多濕梅雨季節(jié)，果實(shí)呼吸作用旺盛、衰老過程很快，嚴(yán)重地影響了其食用價(jià)值［4］。無法鮮食的楊梅主要用于加工成果汁飲料、速溶果粉、果脯、果醋和果酒等產(chǎn)品［5］。楊梅產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生大量的果渣、果核等副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物含有大量多酚物質(zhì)［6］。其中，副產(chǎn)物中的果核殼還沒有得到充分的研究與利用。

天然多酚類物質(zhì)主要來源于水果、蔬菜和其他植物，具有抗氧化、抑菌、抗衰老、降血脂血壓等多種生理功能和藥理作用［7］，引起許多研究者對其的開發(fā)與利用。近年來，從食品加工過程產(chǎn)生的副產(chǎn)品中提取與利用生物活性物質(zhì)引起了廣泛關(guān)注［8］。目前，對楊梅果核殼開發(fā)利用，特別對其多酚物質(zhì)的提取回收、生物活性的研究鮮見報(bào)道。因此開發(fā)利用楊梅果核殼多酚具有重要的意義。本文利用超聲輔助提取楊梅果核殼多酚，采用響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝并研究其抗氧化活性，以期為楊梅果核殼多酚的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

楊梅果核殼，果農(nóng)提供；DPPH、ABTS、維生素C（VC）、過硫酸鉀、沒食子酸、水楊酸鈉、過氧化氫購于麥克林試劑公司；福林酚試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

H1650-W型高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；YQ120型超聲波處理儀（上海易凈超聲儀器有限公司）；H1650Uvmini-1240型紫外可見分光光度計(jì)（島津企業(yè)管理中國有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 楊梅果核殼多酚的提取

將新鮮楊梅果核殼洗凈、烘干、粉碎過100目篩子得楊梅果核殼粉末。稱取一定質(zhì)量果核殼粉末倒入COD管中，按照料液比加入一定濃度乙醇溶液，密封放置于超聲波處理儀提取一定時(shí)間后，取出以12 000 r/min離心作用15 min，取上層清液定容于容量瓶中。根據(jù)Folin-Ciocalteu方法測定提取多酚的質(zhì)量［9］，按照下式計(jì)算楊梅果核殼多酚的提取率。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化楊梅果核殼多酚的提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選擇乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間為提取工藝參數(shù)，以楊梅果核殼多酚的提取率為優(yōu)化指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝。

1.2.3 楊梅果核殼多酚抗氧化活性的測定

根據(jù)LIU等［10］的方法測定楊梅果核殼多酚清除DPPH、ABTS與OH自由基活性，以VC為對照進(jìn)行評價(jià)楊梅果核殼多酚的抗氧化活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)平行測定3次，采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，p< 0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)提取楊梅果核殼多酚

料液比對楊梅果核殼多酚提取率的影響見圖1（a）。多酚提取率隨料液比的增加先增后降，在1：30（g/mL）達(dá)到最大值。這可能是料液比的增加使提取基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)部和外部的多酚物質(zhì)質(zhì)量濃度差增大，有利于多酚的提?。?1］；但料液比超過1：30時(shí)，超聲空化能量密度的降低占了主導(dǎo)地位，對多酚提取不利［12］。所以，選擇料液比為1：30左右進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

乙醇濃度對楊梅果核殼多酚提取率的影響見圖1（b）。多酚提取率隨乙醇濃度的增加先增后降，在乙醇濃度為50%時(shí)達(dá)到最大值。這可能與提取液的極性有關(guān)，不同濃度的乙醇溶液具有不同的極性，濃度為50%乙醇溶液的極性可能與楊梅果核殼多酚的極性相似，當(dāng)乙醇濃度超過50%時(shí)，提取溶液的極性降低，導(dǎo)致提取率降低［13］。所以，選擇乙醇濃度為50%左右進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

超聲時(shí)間對楊梅果核殼多酚提取率的影響見圖1（c）。多酚隨超聲時(shí)間的增加先增后降，在40 min時(shí)提取率達(dá)到最大值。這可能是超聲的機(jī)械攪動(dòng)、空化和熱效應(yīng)可以促進(jìn)提取物從基質(zhì)細(xì)胞壁釋放［14］，增加超聲時(shí)間有利于多酚提取，但超聲時(shí)間過長導(dǎo)致多酚降解，提取率降低［15］。因此，選擇超聲時(shí)間為40 min左右進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 各因素對楊梅果核殼多酚提取率的影響Fig.1 Effect of various factors on extraction ratio of red bayberry kernel shell polyphenols

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化楊梅果核殼多酚提取工藝

2.2.1 方差分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以楊梅果核殼多酚提取率（Y，%）為優(yōu)化目標(biāo)，對乙醇濃度（X1，%）、料液比（X2，g/mL）和超聲時(shí)間（X3，min）采用 3因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化楊梅果核殼多酚的提取工藝。優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析見表1和見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Response surface test design and test results

表2 回歸方程的方差分析Tab.2 Analysis of variance in regression equation

對表1的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到楊梅果核殼多酚提取率（Y）與乙醇濃度（X1）、料液比（X2）和超聲時(shí)間（X3）的三元二次回歸方程：

根據(jù)回歸方程方差分析的結(jié)果（表2）可知，回歸方程的p值小于0.01，表明差異非常顯著，試驗(yàn)方法可靠；失擬項(xiàng)的p值為0.063 6>0.05，表明失擬不顯著，回歸模型與實(shí)測值擬合良好；回歸系數(shù)R2=0.987 5和Radj2=0.965 1，表明該回歸方程具有良好的相關(guān)性，可以很好地反映楊梅果核殼多酚提取率（Y）與乙醇濃度（X1）、料液比（X2）及超聲時(shí)間（X3）之間的關(guān)系。除了相互作用項(xiàng)（X1X2、X1X3、X2X3）外，一次項(xiàng)（X1、X2、X3）和二次項(xiàng)（X12、X22、X32）對多酚提取率都有顯著影響（p<0.05）。根據(jù)F值的大小可知，3個(gè)因素對多酚提取率的影響大小順序?yàn)閄3>X2>X1。以上結(jié)果表明，該回歸方程可以較好地分析和預(yù)測楊梅果核殼多酚的提取，優(yōu)化的方程模型可靠。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

乙醇濃度（X1）、料液比（X2）和超聲時(shí)間（X3）對楊梅果核殼多酚提取率（Y）的三維曲面見圖2，直觀地顯示了每個(gè)因素相互作用時(shí)響應(yīng)面的3D輪廓。從響應(yīng)曲面的3D輪廓和最高點(diǎn)可以看出，在所選因素水平的范圍內(nèi)存在一個(gè)極值，說明因素的水平選擇合理。從圖2中等高線圖的形狀可知，乙醇濃度（X1）和料液比（X2）、乙醇濃度（X1）和超聲時(shí)間（X3）、料液比（X2）和超聲時(shí)間（X3）之間的相互作用對多酚提取率（Y）影響不顯著，這與表2中的方差分析結(jié)果一致。

圖2 各因素對楊梅果核殼多酚提取率影響的三維曲面圖Fig.2 3D diagram of the effect of various factors on extraction ratio of red bayberry kernel shell polyphenols

2.2.3 楊梅果核殼多酚最佳提取工藝的確定

根據(jù)Design-Expert軟件的計(jì)算與實(shí)際操作的考慮，楊梅果核殼多酚最佳提取工藝：乙醇濃度為 44%，料液比 1：32（g/mL），超聲時(shí)間為 44 min。此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，楊梅果核殼多酚的提取率為1.56%，與預(yù)測值偏差1.89%，說明該模型是可靠的。

2.3 楊梅果核殼多酚的抗氧化活性

從楊梅果核殼多酚以VC為對照清除DPPH、ABTS和OH自由基的能力（如圖3）可知，楊梅果核殼多酚和VC清除上述3種自由基的能力隨著樣品濃度的增加而線性增加；楊梅果核殼多酚清除DPPH、ABTS和OH自由基的能力都略低于VC。楊梅果核殼多酚與VC清除DPPH自由基的線性回歸方程分別為y=1.514 2x+0.038（R2=0.997 6）、y=1.582 4x+5.045 3（R2=0.995 1），根據(jù)回歸方程計(jì)算的IC50分別為33.00 μg/mL與28.41 μg/mL，表明楊梅果核殼多酚相當(dāng)于86.09%的VC清除DPPH自由基能力。楊梅果核殼多酚清除DPPH自由基能力比楊梅葉總黃酮（40 μg/mL，91%清除率）低［16］，但比楊梅果多酚（80 μg/mL，90%清除率）要高［17］。楊梅果核殼多酚與VC清除ABTS自由基的線性回歸方程分別為y=0.798 1x+1.802 2（R2=0.998 8）、y=0.934 2x+4.435 1（R2=0.996 4），根據(jù)回歸方程計(jì)算的IC50分別為60.39 μg/mL 與 48.77 μg/mL，表明楊梅果核殼多酚相當(dāng)于80.76%的VC清除ABTS自由基能力。楊梅果核殼多酚清除ABTS自由基能力高于楊梅葉、枝、樹皮（100 μg/mL，約38%清除率）與楊梅疏果核仁苦杏仁苷（IC50 為 281 μg/mL）［18］。楊梅果核殼多酚與VC清除OH自由基的線性回歸方程分別為y=0.279 8x+3.354 7（R2=0.997 5）、y=0.301 1x+5.358（R2=0.999 7），根據(jù)回歸方程計(jì)算的 IC50分別為 166.71 μg/mL 與 148.26 μg/mL，表明楊梅果核殼多酚相當(dāng)于88.93%的VC清除OH自由基能力。楊梅果核殼多酚清除OH自由基能力低于楊梅果多酚（100 μg/mL，75%清除率）、楊梅渣多酚（100 μg/mL，93.2%清除率），但高于楊梅葉多糖（200 μg/mL，45%清除率）［19］。上述試驗(yàn)結(jié)果表明楊梅果核殼多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為天然的抗氧化劑使用。

圖3 樣品對DPPH、ABTS和OH自由基的清除率Fig.3 The scavenging ratio of samples to DPPH，ABTS and OH radicals

3 結(jié)語

以楊梅果核殼為原料，利用超聲輔助提取多酚，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝并研究其抗氧化活性。最佳提取工藝為乙醇濃度44%、料液比1：32（g/mL）、超聲時(shí)間 44 min，此條件下楊梅果核殼多酚提取率為1.56%。楊梅果核殼多酚對DPPH、ABTS和OH自由基清除的IC50分別為 33.00 μg/mL，60.39 μg/mL，166.71 μg/mL，分別相當(dāng)于維生素C清除能力的86.09%、80.76%和88.93%，表明楊梅果核殼多酚具有較好的抗氧化活性，可以作為天然的抗氧化劑使用。