唐慶，楊德泉，佘永紅

湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 吉首 416000

天麻為蘭科植物天麻的干燥塊莖［1］。生品味甘，性平。歸肝經(jīng)。功能與主治為：息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)。用于小兒驚風(fēng)，癲癇抽搐，破傷風(fēng)，頭痛眩暈，手足不遂，肢體麻木，風(fēng)濕痹痛。天麻化學(xué)成分主要有酚類、有機(jī)酸類及植物中常見的甾醇類，其有效成分為天麻素、對(duì)羥基苯甲醇等酚類成分［2-3］。天麻素又名天麻苷，是天麻塊莖中一種含量最高的有效單體成分，其化學(xué)名為4-羥甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，在結(jié)構(gòu)上由4-羥基苯甲醇和葡萄糖兩種單體組成，經(jīng)苦杏仁酶水解后得到對(duì)羥基苯甲醇和葡萄糖兩種單體［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)顯示二者在失眠、驚厥、抑郁、缺血性腦卒中、焦慮、認(rèn)知障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有顯著療效，并且發(fā)現(xiàn)該類疾病與神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子等密切相關(guān)［5］，天麻中對(duì)羥基苯甲醇在體內(nèi)、體外均具有顯著的抗血小板聚集活性［6］。姜天麻為凈天麻片經(jīng)姜制的飲片，炮制目的是增強(qiáng)天麻止痛、抗眩暈之效［7］。張霞等［8］研究探討了姜天麻炮制前后對(duì)硝酸甘油誘導(dǎo)的大鼠偏頭痛的影響，認(rèn)為天麻對(duì)硝酸甘油誘導(dǎo)的大鼠偏頭痛作用，可能是通過降低一氧化氮（NO）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）和提高血漿內(nèi)皮素（ET）、多巴胺（DA）、5-羥色胺（5-HT）的含量，以改善偏頭痛癥狀，且姜天麻較生品作用強(qiáng)，說明炮制后藥效增強(qiáng)。陸平等［7］用HPLC法，以天麻素為含量指標(biāo)，比較了姜天麻、生天麻、硫黃熏蒸天麻的含量，結(jié)果姜天麻中的天麻素含量相對(duì)較高，認(rèn)為可能是天麻在姜制過程中，使得姜汁中的某些易溶出的成分加速了天麻素的溶出，提高了天麻素的溶出率。天麻質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究中，大多僅局限于天麻素的單成分分析，在對(duì)中藥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，選擇單一成分不能夠全面反應(yīng)中藥質(zhì)量。酚類化合物是天麻主要活性成分，天麻素和對(duì)羥基苯甲醇是天麻藥材及含天麻中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分［9］。姜天麻是《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范（2010年版）》［10］收載飲片品種。該標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定方法為HPLC 法測(cè)定天麻素的含量，為使姜天麻飲片質(zhì)量得到更有效地控制，筆者用高效液相法，進(jìn)行了姜天麻飲片中的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇兩種成分含量測(cè)定方法研究，建立了姜天麻的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的含量測(cè)定方法，為定量控制姜天麻質(zhì)量提供了有效手段，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 島津高效液相色譜儀；檢測(cè)器：SPDM20A；色譜柱：日本株式會(huì)社YMC HPLC Column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，型號(hào)：HS12S05-2546WT）；電子天平：METTLER TOLEDO（型號(hào)AB135-S，十萬分之一）；超聲波清洗器（型號(hào)：KQ-200B，功率300 W，40 KHz）。

1.2 試藥

姜天麻飲片5 批（湖南博世康中醫(yī)藥有限公司，批號(hào)201 911025；湖南然潤堂中藥有限公司，批號(hào)2019 112203；湖南衡岳中藥飲片有限公司，批號(hào)19111228-1；湖南振興中藥有限公司，批號(hào)19112525-1；湖南三湘中藥飲片有限公司2020060106）；天麻素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，含量測(cè)定用，批號(hào)：110807-202010，含量以95.5%計(jì)）；對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，含量測(cè)定用，批號(hào)111970-201702，含量以99.4%計(jì)）。乙腈為色譜純（批號(hào)2103542），水為超純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件

色譜柱：YMC HPLC Column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長為220 nm；柱溫35 ℃。理論板數(shù)按天麻素峰計(jì)算，不低于5 000。進(jìn)樣量為5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取天麻素對(duì)照品、對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品各適量，精密稱定，加乙腈-水（3∶97）混合溶液分別制成含天麻素196.539 μg/mL、對(duì)羥基苯甲醇512.407 μg/mL 對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取天麻素對(duì)照品儲(chǔ)備液（196.539 μg/mL）5 mL 及對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品儲(chǔ)備液（512.407 μg/mL）1 mL 同置20 mL 容量瓶中，加乙腈-水（3∶97）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，即得含天麻素49.135 μg/mL、對(duì)羥基苯甲醇25.620 μg/mL 混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品粉末（過三號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，精密量取濾液10 mL，濃縮至近干無醇味，殘?jiān)右译?水（3:97）混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，用乙腈-水（3∶97）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見下圖1、圖2。結(jié)果表明，混合對(duì)照溶液中天麻素與對(duì)羥基苯甲醇保留時(shí)間分別為13.795 min、23.536 min，樣品中天麻素與對(duì)羥基苯甲醇保留時(shí)間分別為13.828 min、23.323 min,樣品中其他成分對(duì)天麻素、對(duì)羥基苯甲醇的測(cè)定無干擾。樣品中理論板數(shù)按天麻素峰計(jì)算為23 839，不低于5 000；樣品中天麻素與前面的雜質(zhì)峰分離度為2.373，對(duì)羥基苯甲醇與天麻素分離度為7.871，均大于1.5；天麻素與對(duì)羥基苯甲醇拖尾因子分別為1.04、0.97，均在0.95～1.05 之間；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 次，記錄色譜峰面積，天麻素RSD=0.09%（n=5），對(duì)羥基苯甲醇RSD=0.22%（n=5），均不大于2.0%；說明系統(tǒng)適用性符合要求。

圖1 天麻素、對(duì)羥基苯甲醇混合對(duì)照溶液HPLC色譜圖

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取天麻素對(duì)照品、對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品各適量，加乙腈-水（3:97）混合溶液分別制成天麻素對(duì)照品儲(chǔ)備液（380.854 μg/mL）及對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品儲(chǔ)備液（179.715 μg/mL）。

精密吸取天麻素對(duì)照品儲(chǔ)備液，對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品儲(chǔ)備液各適量加乙腈-水（3∶97）混合溶液依次稀釋成為含天麻素濃度為152.341 6、114.256 2、76.170 8、47.606 8、23.803 4、9.521 4、0.952 1 μg/mL及含對(duì)羥基苯甲醇濃度為71.886 0、53.914 5、35.943 0、22.464 4、11.232 2、4.492 9、0.449 3 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，濃度為（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。天麻素回歸方程為y=111 535x-643.18，r=0.999 9；對(duì)羥基苯甲醇回歸方程為y=20 768x-3 212.7，r=0.999 9；結(jié)果表明天麻素和對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品分別在0.952 1～152.341 6 μg/mL 和0.449 3～71.886 0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一姜天麻供試品溶液（湖南然潤堂中藥有限公司，批號(hào)2019102203），連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次5 μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算天麻素RSD=1.37%（n=6），對(duì)羥基苯甲醇RSD=0.86%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一姜天麻供試品溶液（批號(hào)2019102203），分別于配制后的0、3、6、12、24 h，精密吸取5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果：天麻素的RSD=1.06%，對(duì)羥基苯甲醇的RSD=1.52%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一姜天麻供試品溶液（批號(hào)2019102203），依“2.2.2”項(xiàng)方法制備6 份供試品溶液，測(cè)定并按干燥品計(jì)算，結(jié)果：天麻素的含量平均值為0.30%，RSD 為0.67%；對(duì)羥基苯甲醇的含量平均值為0.09%，RSD 為2.35%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 耐用性試驗(yàn)

分別用液相色譜儀（1）LC-20AT，色譜柱YMC C18（250mm×4.6mm×5 μm，編號(hào)HS12S05-2546WT，YMC 公司）和（2）Agilent 1260Ⅱ，色譜 柱Agilent C18（250mm ×4.6mm×5 μm，編 號(hào)588905-902，Agilent 公司），平行測(cè)定同一批號(hào)的3 份樣品，結(jié)果3 份樣品天麻素含量分別為：（1）0.30%、0.30%、0.30%；（2）0.29%、0.29%、0.29%。（1）與（2）測(cè)定的3 份含量結(jié)果之間的RSD 均為2.40%；對(duì)羥基苯甲醇含量分別為：（1）0.087%、0.087%、0.084%；（2）0.087%、0.085%、0.087%。（1）與（2）測(cè)定的3 份含量結(jié)果之間的RSD 分別為0%、1.64%、2.48%結(jié)果表明：本方法耐用性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已測(cè)定含量的同一姜天麻供試品溶液（批號(hào)2019102203，含水分10.12%，按干燥品計(jì)算含天麻素0.304 3%、對(duì)羥基苯甲醇0.086 %）約1 g（9 份），精密稱定，置具塞錐形瓶中，按含量的80%、100%和120%左右的水平精密加入濃度為1 896.152 5 μg/mL 的天麻素對(duì)照品及濃度為1 015.868 5 μg/mL 對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品適量（所用量具為經(jīng)校正的刻度吸管），見表1、表2，依“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果天麻素及對(duì)羥基苯甲醇平均加樣回收率分別為99.18%、95.21%。RSD 分別為2.65%（n=9）、2.75%（n=9）表明本方法加樣回收率良好。

表1 天麻素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表

表2 對(duì)羥基苯甲醇加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表

2.10 樣品含量測(cè)定

取姜天麻飲片5 批（批號(hào)：201911025、2019112203、19111228-1、19112525-1、2020060106），按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，分別按外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

采用HPLC 法或UPLC 法分析天麻和天麻飲片中成分的含量，研究報(bào)道較多，分析檢測(cè)天麻中的成分有天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E、對(duì)羥基苯甲醇、原兒茶酸等［11-15］。在采用HPLC 法測(cè)定姜天麻中的主要成分含量的研究方面，報(bào)道較少［7］?！吨袊幍洹?020 年版一部［1］天麻的標(biāo)準(zhǔn)中，天麻的含量測(cè)定成分為天麻素和對(duì)羥基苯甲醇。因此，本方法以姜天麻中的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇作為含量測(cè)定成分。本實(shí)驗(yàn)建立的測(cè)定姜天麻飲片中的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量的方法，快速，準(zhǔn)確，高效，靈敏，為姜天麻的質(zhì)量控制提供了有效的檢測(cè)手段。