廖玉群，康志華，付向紅，楊雷，熊家偉

江西藥都仁和制藥有限公司，江西 樟樹 331200

婦炎凈片處方由當(dāng)歸、雞血藤、苦玄參、地膽草、菥蓂、五指毛桃、橫經(jīng)席、兩面針、柿葉九味組成，具有清熱祛濕，調(diào)經(jīng)止帶之功效，用于濕熱蘊(yùn)結(jié)所致的帶下病、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)；慢性盆腔炎、附件炎、子宮內(nèi)膜炎等證。方中兩面針具有祛風(fēng)通絡(luò)，滲濕止痛，抗炎抗菌等活性［1］。本品為江西藥都仁和制藥有限公司擬進(jìn)行二次開發(fā)的重點(diǎn)產(chǎn)品之一，現(xiàn)執(zhí)行國家標(biāo)準(zhǔn)YBZ13472005-2009Z，標(biāo)準(zhǔn)中已有苦玄參、兩面針、地膽草、雞血藤的薄層鑒別，以及氯化兩面針堿的含量測定，其中氯化兩面針堿的含量規(guī)定每片中不得少于0.08 mg；而市場上秦皇島皇威制藥有限公司的同品種氯化兩面針堿的含量規(guī)定每片中不得少于0.22 mg（執(zhí)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZA12312006）。故在二次開發(fā)中，為進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量及質(zhì)量的可控性，對(duì)本品中氯化兩面針堿的含量及其測定方法進(jìn)行了研究，對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)含量測定方法進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后的方法操作簡便，重復(fù)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確，具有專屬性；同時(shí)提高了氯化兩面針堿的內(nèi)控含量指標(biāo)，由原標(biāo)準(zhǔn)中每片不少于0.08 mg，提高為每片不少于0.20 mg。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：島津LC-20AD、安捷侖1260 Ⅱ；電子天平：CP224S 賽多利斯（d=0.1 mg）及CP225D（d=0.01 mg、0.1 mg）。

1.2 試藥

氯化兩面針堿對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110848-201802，含量以91.0%計(jì)，使用前不需干燥處理）；婦炎凈片樣品（由江西藥都仁和制藥有限責(zé)任公司提供，批號(hào)：191001、191002、191003、200301、200302、200303、200801、200802、200901、210301）；

乙腈為色譜純（購自美國天地公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 原注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水-三乙胺（23∶77∶0.3）（用磷酸調(diào)pH 值為3.0）為流動(dòng)相；檢測波長為328 nm。理論板數(shù)按氯化兩面針堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取氯化兩面針堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含5 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取重量差異項(xiàng)下的樣品，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，精密加入1%鹽酸甲醇溶液50 mL，穩(wěn)定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用1%鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足重量，濾過，精密吸取續(xù)濾液10 mL，過中性氧化鋁柱（100-200目，10 g，內(nèi)徑1.5 cm），用甲醇50 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 測定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

在大量的生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，本法重現(xiàn)性不理想，影響因素較多，結(jié)果偏差較大，加樣回收率偏低，不能真實(shí)反映出氯化兩面針堿的含量。

2.2 改進(jìn)后的方法

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［2-7］以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈：0.02 mol/L KH2PO4（22∶78）；檢測波長為328 nm。理論板數(shù)按氯化兩面針堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取氯化兩面針堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含10 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備［8-9］取重量差異項(xiàng)下的樣品，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，精密加入1%鹽酸甲醇溶液50 mL，穩(wěn)定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用1%鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足重量，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH 1～2 后，用三氯甲烷振搖提取3 次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)眉状际谷芙猓哭D(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 測定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.5 分析方法確認(rèn) 按照《中國藥典》2020 年版四部通則9101 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，選取線性關(guān)系、專屬性、定量限、回收率、精密度、耐用性、穩(wěn)定性作為確認(rèn)指標(biāo)，對(duì)改進(jìn)后的分析方法進(jìn)行了確認(rèn)，結(jié)果如下。

線性關(guān)系考察：以氯化兩面針堿的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=46.869X-2.162，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9（n=6）。氯化兩面針堿質(zhì)量濃度在2.06～51.50 μg/ mL范圍內(nèi)與峰面積線性良好。

專屬性試驗(yàn)：色譜圖中，氯化兩面針堿能夠較好地分離，保留時(shí)間適中，陰性無干擾，專屬性好。

精密度試驗(yàn)：取氯化兩面針堿對(duì)照品溶液（濃度為20.60 μg/ mL），連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積，結(jié)果的RSD 為0.66%（n=6），小于2%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按供試品溶液制備方法制成供試品溶液（批號(hào)191001），同時(shí)取氯化兩面針堿對(duì)照品溶液（20.60 μg/ mL），分別在放置0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，測定峰面積，結(jié)果的RSD 為1.3%（n=8），表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)191001）6 份，按正文中含量測定項(xiàng)下方法試驗(yàn)，測定氯化兩面針堿的含量，結(jié)果6 份樣品所測得氯化兩面針堿平均含量為289.22 μg/片，RSD 為1.6%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

定量限：當(dāng)信噪比為10∶1 時(shí)，氯化兩面針堿的濃度為20 ng/mL。

圖1 高效液相色譜圖：A.陰性樣品；B.供試品；C.對(duì)照品

2.3 原注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法及改進(jìn)后的方法對(duì)比

取樣品（批號(hào)191001），分別采用原注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法及改進(jìn)后的方法，進(jìn)行精密度、加樣回收率以及耐用性試驗(yàn)，測定氯化兩面針堿的含量，檢測結(jié)果匯總見表1～3。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比（μg/片）

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比（%）

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比（μg/片）

結(jié)果，原注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法精密度、加樣回收試驗(yàn)及耐用性試驗(yàn)的RSD 分別為1.9%、3.3%和1.9%，改進(jìn)后方法的精密度、加樣回收試驗(yàn)及耐用性試驗(yàn)的RSD 分別為0.4%、0.7%和0.3%，表明改進(jìn)后的方法較原方法的精密度、準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性更理想，原方法加樣回收率偏低，改進(jìn)后的方法平均加樣回收率為99.5%，表明結(jié)果準(zhǔn)確，更能真實(shí)地反應(yīng)出本品中氯化兩面針堿的含量，可用于本品的質(zhì)量控制。

3 樣品測定

取本品，分別按原方法及改進(jìn)后的方法測定氯化兩面針堿的含量，改進(jìn)后的方法檢測的氯化兩面針堿的含量均比原方法檢測結(jié)果高；考慮到不同產(chǎn)地的兩面針中氯化兩面針堿的含量有高有低［10］，擬將氯化兩面針堿的含量由每片不得少于0.08 mg，提高至每片不得少于0.20 mg。檢測結(jié)果見表4。

表4 10批樣品中氯化兩面針堿的含量（μg/ 片）

4 討論

4.1 流動(dòng)相的選擇

氯化兩面針堿屬苯駢菲喧類生物堿，其結(jié)構(gòu)中堿性氮原子與固定相未鍵臺(tái)酸性硅醇基的相互作用，使得色譜峰的展寬拖尾，峰漂移及峰對(duì)稱性差，導(dǎo)致分離效能低。故對(duì)比了在流動(dòng)相中加添加緩沖鹽及有機(jī)胺改性劑的效果，結(jié)果乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（22∶78）的效果優(yōu)于乙腈-水-三乙胺（23∶77∶0.3）（用磷酸調(diào)pH 值為3.0），況且三乙胺對(duì)色譜柱的損害不易逆轉(zhuǎn)，故選擇采用乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（22∶78）為流動(dòng)相。

4.2 檢測波長的選擇

氯化兩面針堿對(duì)照品溶液及供試品溶液在271 nm及328 nm 處均有吸收峰，在328 nm 下的色譜圖中雜質(zhì)干擾峰稍少，故仍選取328 nm 作為檢測波長，不做修訂。

4.3 供試品溶液的制備

修訂的方法采用1%的鹽酸酸化的甲醇進(jìn)行回流提取，可以使游離的兩面針堿結(jié)合成為無機(jī)酸鹽，從而能夠提高氯化兩面針堿的提取率；但同時(shí)使得提出的雜質(zhì)也增多；大多數(shù)游離生物堿都是親脂性的，故甲醇液蒸干后，加水使溶解調(diào)pH1～2,再用三氯甲烷萃取，以達(dá)到分離純化的目的。原方法中采用通過中性氧化鋁柱進(jìn)行分離純化，結(jié)果，在去除雜質(zhì)的同時(shí)，將目標(biāo)成分氯化兩面針堿同時(shí)損失了一部分，造成檢測結(jié)果比真實(shí)含量偏低，結(jié)果不準(zhǔn)確。

試驗(yàn)中，對(duì)各試驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選，如不同提取溶劑、回流提取時(shí)間、萃取次數(shù)、流動(dòng)相比例等，結(jié)果以正文條件為佳。所建立的方法操作簡便，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性理想，結(jié)果準(zhǔn)確，優(yōu)于原方法，能真實(shí)地反應(yīng)本品中氯化兩面針堿的含量?？捎糜趮D炎凈片的質(zhì)量控制。