常金圓，李淏，江正龍，馮利

1.國(guó)家癌癥中心／國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心／中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，北京 100021；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

疼痛是癌癥診斷中最為常見(jiàn)的表現(xiàn)特征，同時(shí)也是癌癥患者在整個(gè)疾病過(guò)程中最為恐懼的癥狀。大約45%的癌癥晚期患者經(jīng)歷了中、重度疼痛［1］，然而在臨床中這類疼痛往往是難以緩解的［2］。因其發(fā)生機(jī)制過(guò)于復(fù)雜，導(dǎo)致治療方法局限，治療效果欠佳。目前臨床普遍應(yīng)用WHO“三階梯止痛療法”治療癌性疼痛，然而其帶來(lái)的不良反應(yīng)通常導(dǎo)致患者難以持續(xù)接受治療［3－4］。中醫(yī)將其歸于“痛證”范疇，究其病機(jī)不外乎“不通則痛”及“不榮則痛”兩端。癌毒與痰瘀互結(jié)，發(fā)為癌腫，導(dǎo)致脈絡(luò)閉阻，發(fā)為疼痛，此為不通則痛；日久邪傷正氣，氣血虛弱，導(dǎo)致無(wú)法濡養(yǎng)臟腑經(jīng)絡(luò)，發(fā)為疼痛，此為不榮則痛。

少腹逐瘀湯出自王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》一書，由當(dāng)歸、川芎、小茴香、干姜、延胡索、沒(méi)藥、肉桂、赤芍、蒲黃、五靈脂10味藥組成，具有養(yǎng)血活血、通利血脈、溫經(jīng)散寒、理氣除濕、化瘀止痛的作用。臨床普遍應(yīng)用于婦科及男科疾病的治療［5］，因其化瘀通利的特性，故而在治療腫瘤相關(guān)病癥方面也有獨(dú)特的作用。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)少腹逐瘀湯干預(yù)后，可使模型大鼠體內(nèi)白細(xì)胞介素－6（interleukin－6，IL－6）及腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNFα）水平降低，抑制炎性介質(zhì)合成和釋放，提高機(jī)體免疫力［6］。醋酸扭體實(shí)驗(yàn)和棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，少腹逐瘀湯能明顯抑制醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)，表明其對(duì)炎性疼痛具有一定的抑制作用［7］。中藥復(fù)方因其多中藥、多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同的特點(diǎn)，應(yīng)用目前現(xiàn)有的研究手段，通常不能全面解釋其作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從宏觀、系統(tǒng)的角度，探尋藥物治療疾病的整體效應(yīng)，打破了以往單化合物、單靶點(diǎn)的研究模式，為研究中藥復(fù)方提供了新的思路。

1 資料與方法

1.1 少腹逐瘀湯活性成分和相關(guān)靶點(diǎn)篩選本研究利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）及BATMAN－TCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／bionet.ncpsb.org／batman－tcm／）構(gòu)建少腹逐瘀湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)所含中藥：依據(jù)口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（druglikeness，DL）≥0.18為條件，篩選其活性成分［8］，及有效化合物相關(guān)的靶點(diǎn)。非TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中藥：通過(guò)BATMAN－TCM數(shù)據(jù)庫(kù)查詢中藥相關(guān)活性成分，并設(shè)定評(píng)分＞20，作為活性靶點(diǎn)的篩選依據(jù)［9］。并將靶點(diǎn)通過(guò)uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.uniprot.org）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 癌性疼痛相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)以“cancer－related pain”為檢索詞，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)［10］（https：／／www.GeneCards.org／）查詢癌性疼痛相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 少腹逐瘀湯中藥－活性化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將藥物－疾病交集靶點(diǎn)以及藥物活性化合物導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中［11］，繪制少腹逐瘀湯與癌性疼痛中藥－活性化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 少腹逐瘀湯化學(xué)成分靶點(diǎn)蛋白互作（proteinprotein interaction，PPI）及Hub基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將交集靶點(diǎn)上傳到String11.0數(shù)據(jù)庫(kù)中（https：／／www.string－db.org），選擇物種為人源，最低相互作用閾值設(shè)定為0.9，證據(jù)類型設(shè)置為來(lái)源于實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)以及共表達(dá)，建立PPI網(wǎng)絡(luò)。并將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，應(yīng)用Cytohubba插件［12］，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的最大中心性MCC值，繪制Hub基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 少腹逐瘀湯對(duì)癌性疼痛作用靶點(diǎn)生物功能注釋分析將交集得到的靶點(diǎn)，利用Bioconductor中的R包c(diǎn)lusterprofile v3.12.0，設(shè)定P＜0.05，進(jìn)行GO富集分析及KEGG富集分析［13］。

1.6 少腹逐瘀湯治療癌性疼痛的分子對(duì)接驗(yàn)證通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.rcsb.org）下載蛋白結(jié)構(gòu)，并將其導(dǎo)入對(duì)接模擬軟件AutoDock，與Degree值排名前5位的關(guān)鍵藥效分子進(jìn)行對(duì)接模擬計(jì)算，并以靶點(diǎn)蛋白相應(yīng)的配體作為陽(yáng)性對(duì)照。完成對(duì)接模擬之后，根據(jù)關(guān)鍵藥效分子和靶點(diǎn)蛋白最強(qiáng)親和力值繪制熱圖。并篩選結(jié)合最穩(wěn)定的對(duì)接結(jié)構(gòu)，利用ligplot繪制對(duì)接模式圖。

2 結(jié)果

2.1 少腹逐瘀湯與癌性疼痛靶點(diǎn)全局性網(wǎng)絡(luò)分析共收集到化合物1 219種，依據(jù)篩選條件進(jìn)行篩選，刪重后共有139種，藥物靶點(diǎn)344個(gè)，疾病相關(guān)靶點(diǎn)906個(gè)，其中藥物與疾病相同靶點(diǎn)104個(gè)（圖1A）。通過(guò)Cytoscape 3.7.2構(gòu)建中藥－活性化合物－靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)圖，通過(guò)network analyze計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，結(jié)果一共得到204個(gè)節(jié)點(diǎn)，854條邊。按照Degree值對(duì)活性化合物進(jìn)行排序，得到排名前5位的化合物為槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、β－谷甾醇（MOL000358）、豆甾醇（MOL000449）、益母草素（MOL004215）（圖1B）。排名前5位的活性化合物與疾病靶點(diǎn)相互作用見(jiàn)圖1C。提示在應(yīng)用少腹逐瘀湯治療癌性疼痛中，這些化合物具有關(guān)鍵作用。

圖1 少腹逐瘀湯與癌性疼痛靶點(diǎn)全局性網(wǎng)絡(luò)分析示意圖

2.2 少腹逐瘀湯治療癌性疼痛核心靶點(diǎn)分析將104個(gè)交集靶點(diǎn)上傳到String11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，建立PPI網(wǎng)絡(luò)，共得到74個(gè)節(jié)點(diǎn)，234條邊（圖2A）。為了進(jìn)一步探求PPI網(wǎng)絡(luò)中核心蛋白之間的相互作用關(guān)系，應(yīng)用cytohubba插件，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的最大中心性MCC值，并繪制Hub基因網(wǎng)絡(luò)圖（圖2B）。其中ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、CHRM2及AVP的MCC值較高。

圖2 少腹逐瘀湯治療癌性疼痛核心靶點(diǎn)分析圖

2.3 少腹逐瘀湯對(duì)癌性疼痛作用靶點(diǎn)的GO分析和KEGG分析利用R包c(diǎn)lusterprofile一共得到GO條目1 718條，主要富集在調(diào)節(jié)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢灰约把装Y的發(fā)生（表1）。KEGG富集顯示，少腹逐瘀湯通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路、核因子κB亞單位（nuclear factor kappa B subunit，NF－kappa B）信號(hào)通路以及瞬時(shí)受體電位信號(hào)通路，達(dá)到治療癌痛的作用。見(jiàn)表2。

表1 少腹逐瘀湯生物學(xué)功能富集結(jié)果

表2 少腹逐瘀湯KEGG富集結(jié)果

2.4 少腹逐瘀湯治療癌性疼痛分子對(duì)接結(jié)果驗(yàn)證對(duì)12個(gè)關(guān)鍵靶蛋白及5個(gè)關(guān)鍵化合物分子對(duì)接的最低結(jié)合能做熱圖（圖3）。由圖3所示，所有分子與靶標(biāo)蛋白的最低結(jié)合能均小于－1.2 kcal·mol－1，說(shuō)明所有活性化合物與受體均能結(jié)合。其中CHRM2、F2R、P38及TNF－α結(jié)合最緊密。靶點(diǎn)蛋白基本信息見(jiàn)表3。

表3 靶點(diǎn)蛋白基本信息表

圖3 分子對(duì)接結(jié)果熱圖

為了進(jìn)一步探究CHRM2、F2R、P38及TNF－α與化合物的結(jié)合模式，選取各自對(duì)接最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析，其中，CHRM2與β－谷甾醇結(jié)合最緊密，F(xiàn)2R、P38和TNF－α與豆甾醇結(jié)合最緊密（圖4）。

圖4 對(duì)接結(jié)果模式圖

結(jié)果表明，小分子化合物和蛋白靶點(diǎn)均可通過(guò)形成疏水作用以及范德華力從而形成穩(wěn)定結(jié)合，其中，豆甾醇還可以與F2R和TNF－α分別在Leu40和Glu110殘基位點(diǎn)上形成氫鍵，與P38在Glu81以及Asn82殘基位點(diǎn)上形成氫鍵，從而增強(qiáng)結(jié)合的穩(wěn)定性。

3 討論

少腹逐瘀湯是治療婦科瘀血內(nèi)阻的代表方之一，將此方加減后應(yīng)用于癌性疼痛的治療，是取此方溫經(jīng)散寒、化瘀止痛之功用，同時(shí)也符合腫瘤發(fā)生的中醫(yī)病機(jī)［14］。癌性疼痛的發(fā)病機(jī)制尚未明確，包含了神經(jīng)病理痛和炎性疼痛的特性，但其機(jī)制遠(yuǎn)比以上兩種疼痛復(fù)雜，對(duì)機(jī)制研究的不足也是限制癌性疼痛治療效果的原因之一。西醫(yī)治療手段和靶點(diǎn)相對(duì)單一，針對(duì)癌痛多靶點(diǎn)的特性，中藥復(fù)方多靶點(diǎn)、多成分協(xié)同作用，使得臨床中應(yīng)用少腹逐瘀湯治療癌性疼痛往往頗有療效。

研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山柰酚、β－谷甾醇、豆甾醇及益母草素的Degree值高于其余成分，說(shuō)明這些藥物成分可能是少腹逐瘀湯治療癌性疼痛的關(guān)鍵成分。槲皮素及山柰酚均屬于黃酮類化合物。有研究發(fā)現(xiàn)，兩者均可影響細(xì)胞因子的分泌，快速清除DPPH和ABTS自由基，有效抑制TNF－α的分泌［15］；β－谷甾醇及豆甾醇都屬于植物甾醇類成分，兩者均有抗腫瘤及抗炎作用。有研究發(fā)現(xiàn)，β－谷甾醇通過(guò)減少NO的合成，抑制IL－6活性，減少TNF等炎性因子的分泌［16］；豆甾醇能明顯減少由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激增多的環(huán)氧化酶－2和誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）mRNA的表達(dá)，從而達(dá)到抑制炎癥的作用［17］。分子對(duì)接結(jié)果表明，這兩種植物類甾醇，均可以同CHRM2、F2R、P38及TNF－α穩(wěn)定結(jié)合，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛的作用。其中延胡索的連接度最高，并且關(guān)鍵化合物中槲皮素、豆甾醇和益母草素均來(lái)源于延胡索，證明延胡索治療癌性疼痛中的炎性來(lái)源疼痛確有療效。

對(duì)少腹逐瘀湯治療癌性疼痛的KEGG富集研究發(fā)現(xiàn)，少腹逐瘀湯能夠影響促興奮性氨基酸的合成，并通過(guò)神經(jīng)活性配體－受體相互作用影響疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)，表明少腹逐瘀湯有效成分可能通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，從而達(dá)到治療癌性疼痛的目的。在治療腫瘤方面，一共富集出腫瘤有關(guān)通路15條（9.87%），并主要富集在結(jié)直腸癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌等腹盆腔腫瘤中。這提示應(yīng)用少腹逐瘀湯在治療腹盆腔腫瘤所致的癌性疼痛過(guò)程中，也會(huì)對(duì)原發(fā)腫瘤產(chǎn)生治療效果。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，CHRM2、F2R、P38及TNF－α與受體對(duì)接效果更加緊密，意味著在治療癌性疼痛方面可能發(fā)揮更為重要的作用。CHRM2是毒蕈堿樣膽堿能受體（muscarinic cholinergic receptor mAChRs）的M2亞型，通過(guò)G蛋白抑制腺苷酸環(huán)化酶促使環(huán)磷酸腺苷減少，從而在神經(jīng)調(diào)節(jié)鎮(zhèn)痛方面起到重要作用。誘導(dǎo)CHRM2在神經(jīng)病理性疼痛中正常表達(dá)，可以有效增強(qiáng)毒蕈堿對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用［18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小茴香、干姜、當(dāng)歸、沒(méi)藥、蒲黃、赤芍、延胡索可以靶向該蛋白，意味著少腹逐瘀湯通過(guò)這些藥物可以對(duì)癌性疼痛中的神經(jīng)源性疼痛產(chǎn)生治療作用。

F2R是PAR－1的別稱，是凝血酶受體，屬于蛋白酶活化受體家族（protease－activated receptors，PARs），能夠被凝血酶激活，并通過(guò)傳入神經(jīng)元，降低疼痛閾值。研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射凝血酶，可以引起長(zhǎng)期的痛覺(jué)過(guò)敏［19－20］。并且PAR－1在體外通過(guò)多種機(jī)制參與癌細(xì)胞的侵襲和傳播，降低上皮細(xì)胞鈣黏蛋白，并增加α－平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，兩者都是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志［21］。最近發(fā)現(xiàn)PAR－1在肺癌、大腸癌、前列腺癌和卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞株中均有高表達(dá)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，少腹逐瘀湯中小茴香、川芎、延胡索、沒(méi)藥、蒲黃均可靶向F2R，說(shuō)明少腹逐瘀湯不僅能起到止痛的作用，對(duì)原發(fā)腫瘤也有一定程度的治療作用。

P38 MAPK信號(hào)通路是絲裂酶原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPKs）家族中重要組成部分。MAPK是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，多種炎癥因子及應(yīng)激反應(yīng)可使p38 MAPK的酪氨酸和蘇氨酸雙磷酸化，從而激活p38 MAPK，參與疼痛的發(fā)生和維持［22］。分子對(duì)接結(jié)果表明，少腹逐瘀湯中的有效化學(xué)成分，可以與其緊密結(jié)合，參與p38 MAPK的調(diào)節(jié)。

TNF－α是一種致炎細(xì)胞因子，作為一種參與疼痛發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)因子，在神經(jīng)軸突內(nèi)逆行或順行運(yùn)輸。正常情況下，TNF在神經(jīng)組織中表達(dá)水平較低，在神經(jīng)組織自身缺血、受損、炎性病變時(shí)，TNF－α的含量迅速升高，能通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)致痛物質(zhì)前列腺素E2、緩激肽的產(chǎn)生，在疼痛形成與維持的過(guò)程中扮演重要角色。延胡索、沒(méi)藥、蒲黃、赤芍均可靶向TNF－α，調(diào)節(jié)炎癥的發(fā)生發(fā)展，并緩解由炎癥所致疼痛。

綜上，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)少腹逐瘀湯治療癌性疼痛的機(jī)制進(jìn)行探索。少腹逐瘀湯對(duì)癌性疼痛的治療是基于多組分、多靶點(diǎn)、多通道的綜合藥理作用，為晚期腫瘤患者疼痛治療提供參考，也為下一步的研究提供理論基礎(chǔ)。