王思威，孫海濱，劉艷萍，曾廣豐，王瀟楠，常 虹，曾鑫年

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 廣東省昆蟲行為調(diào)控工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所， 廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

荔枝原產(chǎn)于中國，是我國熱區(qū)的第一大水果[1-2]，是最具嶺南特色的名優(yōu)果品，中國是世界上荔枝產(chǎn)量最大和栽培面積最廣的國家[3-5]，荔枝是我國華南地區(qū)重要的蜜源性經(jīng)濟(jì)作物。嶺南高溫高濕的氣候環(huán)境特征導(dǎo)致荔枝上病蟲害頻發(fā)[6]，尤其在荔枝花期和果期，病蟲害發(fā)生可導(dǎo)致荔枝的成花率低、坐果率下降，從而影響荔枝的產(chǎn)量和質(zhì)量[7]。目前化學(xué)防治仍為主要技術(shù)措施。荔枝上主要病蟲害有蒂蛀蟲、椿象、霜疫霉病、炭疽病等，主要防控藥劑為菊酯類、苯甲酰脲類、有機(jī)磷類、甲氧基丙烯酸酯類、三唑類等化學(xué)農(nóng)藥[8-13]。荔枝需要借助蜜蜂等昆蟲媒介完成授粉，蜜蜂在授粉過程中也將蜜汁和花粉帶回蜂巢，受農(nóng)藥的內(nèi)吸傳導(dǎo)特性和漂移作用影響，荔枝花中的蜜汁和花粉會含有部分農(nóng)藥，通過蜜蜂轉(zhuǎn)運(yùn)作用，蜂巢和蜂蜜中也會存在農(nóng)藥殘留[14-15]。因此，本研究以荔枝花、蜂巢和蜂蜜為篩查對象，快速分析其中的農(nóng)藥殘留水平，為后續(xù)評估農(nóng)藥對蜜蜂的暴露風(fēng)險等研究內(nèi)容提供基礎(chǔ)。

目前，有關(guān)蜂蜜中農(nóng)藥的檢測方法一般為氣相色譜（gas chromatography，GC）法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）聯(lián)用法、高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法[16-25]，其中GC法和HPLC法的定性能力較弱，且GC、HPLC、GC-MS、HPLC-MS/MS法的定性分析必須有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比對。四極桿飛行時間質(zhì)譜（quadrupoletime of flight mass spectrometry，Q-TOF-MS）具有數(shù)據(jù)采集速度快、分辨能力高、質(zhì)量精度高、檢測靈敏度高等多重優(yōu)點(diǎn)，可依據(jù)化合物的質(zhì)量數(shù)、保留時間、同位素強(qiáng)度、二級碎片等質(zhì)譜信息匹配數(shù)據(jù)庫，從而實(shí)現(xiàn)在無標(biāo)準(zhǔn)品比對的條件下對目標(biāo)化合物進(jìn)行定性，該技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品、畜產(chǎn)品等領(lǐng)域中有害物質(zhì)篩查方面得到廣泛 應(yīng)用[26-30]。目前鮮見以荔枝花、蜂巢和荔枝蜜為基質(zhì)的農(nóng)藥篩查分析報道。

本實(shí)驗(yàn)以荔枝花、蜂巢和蜂蜜為研究對象，采用改進(jìn)的QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）前處理方法結(jié)合HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)快速篩查多種農(nóng)藥。該法分析速度快、精準(zhǔn)可靠，旨在為全面快速分析荔枝花、蜂巢和蜂蜜中的農(nóng)藥多殘留提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；甲酸（色譜純） 美國Fluka公司；十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、N-丙基乙二胺吸附劑（primary secondary amine，PSA） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥95%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司。準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈稀釋成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別準(zhǔn)確吸取1 mL各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用含0.1%甲酸的乙腈溶液定容至10 mL，配制100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃避光保存。

1.2 儀器與設(shè)備

20AD高效液相色譜儀 日本島津公司；TripleTOF? 5600+高分辨質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX 公司；Milii-Q超純水機(jī) 美國Millipore公司；GTR22-1離心機(jī) 北京時代北利離心機(jī)有限公司；OA-SYS 氮吹儀 美國Organomation Associates公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取荔枝花或蜂巢樣品5.0 g，荔枝蜜樣品10 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，加入10 mL超純水浸潤荔枝花和蜂巢樣品，渦旋使蜂蜜樣品成均質(zhì)溶液，在45 ℃水浴中放置30 min，再加入20 mL乙腈進(jìn)行提取，然后加入5 g氯化鈉和2 g無水硫酸鎂，立即劇烈振蕩，渦旋1 min，以5 000 r/min離心5 min。取10 mL乙腈層溶液，氮?dú)獯抵良s50 μL，乙腈定容至2 mL，轉(zhuǎn)移至加有0.15 g無水硫酸鎂、0.025 g PSA和0.025 g C18的離心管中，劇烈振蕩，渦旋10 s，再以10 000 r/min離心2 min。取上清液，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待HPLC-Q-TOF-MS測定。

1.3.2 檢測條件

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Xbridge BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱溫30 ℃；梯度洗脫：流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫條件見表1；進(jìn)樣量5 μL；流速0.5 mL/min。

表1 色譜梯度洗脫程序Table 1 Chromatographic gradient elution procedures

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：大氣壓電噴霧電離源和大氣壓化學(xué)電離源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）復(fù)合源；APCI源：連接AB SCIEX公司自動校正系統(tǒng)，每5 個樣品自動校正1 次，以保證系統(tǒng)精確質(zhì)量數(shù)的穩(wěn)定性。校正液流速0.5 mL/min；一級TOF-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍100～1 000 Da；數(shù)據(jù)采集時間100 ms；二級IDA-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍50～1 000 Da；高靈敏模式；數(shù)據(jù)采集時間50 ms；信號閾值100 cps。IDA實(shí)驗(yàn)每循環(huán)采集6 次數(shù)據(jù)，動態(tài)背景減法扣除。離子源內(nèi)參數(shù)見表2。

表2 TOF-IDA-MS模式質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Spectrometric parameters under the TOF-IDA-MS mode

1.3.3 篩查與鑒定方法

高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)在AB SCIEX公司的Analyst TF 1.6軟件采集，采用PeakView 2.0、MasterView 2.0軟件對實(shí)際樣品中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行篩查。結(jié)合荔枝上登記的農(nóng)藥種類、荔枝產(chǎn)地實(shí)際樣品調(diào)研及測定結(jié)果、荔枝上的相關(guān)技術(shù)規(guī)程，導(dǎo)入45 種農(nóng)藥的名稱和分子式，建立高分辨質(zhì)譜篩查XIClist列表，該列表的建立是篩查分析的重要依據(jù)，直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。篩查列表保留時間限定范圍為±0.2 min，精確質(zhì)量偏差為±1×10－5，離子化模式設(shè)定為+H模式。軟件會計算化合物的實(shí)測值與理論值的偏差，通過分子離子的精確質(zhì)量偏差、同位素分布、同位素比例和保留時間等的計算，給出相應(yīng)的檢索匹配得分值，對于檢索結(jié)果得分值不小于80的化合物，本方法確認(rèn)其為檢出農(nóng)藥。根據(jù)上述篩選出的化合物，對其標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行儀器分析，進(jìn)一步驗(yàn)證篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性，利用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化及評價

荔枝花、蜂巢和蜂蜜中含有大量糖類、色素、黃酮類物質(zhì)，屬于較復(fù)雜基質(zhì)，樣品如果不經(jīng)凈化直接進(jìn)樣，容易對目標(biāo)物的定性定量分析產(chǎn)生干擾，影響確證的準(zhǔn)確性，同時會對色譜柱、質(zhì)譜系統(tǒng)等造成嚴(yán)重污染，導(dǎo)致儀器日常維護(hù)的人力和財力成本增加。因此對荔枝花、蜂巢和蜂蜜樣品的凈化十分必要。

蜂巢和蜂蜜樣品中含有大量糖分，通過在45 ℃水浴中放置30 min，可使樣品中的糖類充分溶解出來，避免凝固，影響后續(xù)凈化過程；水浴溫度過高可導(dǎo)致未知農(nóng)藥的分解現(xiàn)象發(fā)生，影響定性定量結(jié)果。目前水果、蔬菜等中的有害化學(xué)物質(zhì)的限量水平越來越低，因此需要更為有效和更加靈敏的分析方法檢測復(fù)雜基質(zhì)中的有害物質(zhì)含量，QuEChERS法具有操作簡便快速、分析物回收率穩(wěn)定的獨(dú)特優(yōu)勢，使其廣泛應(yīng)用于果蔬等多種基質(zhì)中的農(nóng)殘檢測。

提取溶劑選擇乙腈，是因其具有極性強(qiáng)、提取范圍廣、提取農(nóng)藥種類多以及提取樣品色素雜質(zhì)少等特點(diǎn)，是農(nóng)藥殘留檢測中常用的提取溶劑。荔枝花和蜂巢樣品中含有大量蜂蠟、樹脂、色素等成分，蜂蜜樣品中含有糖類物質(zhì)，PSA屬弱陰離子交換填料，可有效去除樣品中的色素和糖類等物質(zhì)；C18吸附劑具有較大的比表面積，對脂肪、脂類等非極性干擾物具有較強(qiáng)的吸附能力，去除效果顯著；無水硫酸鎂主要用于去除樣品中的多余水分，增加目標(biāo)農(nóng)藥在有機(jī)溶劑中的溶解度。通過PSA+C18聯(lián)合應(yīng)用能夠明顯去除脂類和糖類物質(zhì)的干擾，使目標(biāo)物的添加回收率滿足分析要求。

2.2 定性分析

自建高分辨數(shù)據(jù)庫是實(shí)現(xiàn)非靶向篩查的基礎(chǔ)，將待篩查領(lǐng)域項(xiàng)目中所涉及的所有化合物分子式導(dǎo)入MasterView 2.0構(gòu)成篩查數(shù)據(jù)庫。本研究一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜兼顧高分辨率和高靈敏度平衡模式，得到的譜圖既有母離子的精確質(zhì)量數(shù)，又自動觸發(fā)母離子峰高大于5 000 cps的二級質(zhì)譜全掃描采集，完全滿足定性和定量要求。采集的一級質(zhì)譜圖包含化合物的精確質(zhì)量數(shù)和分子式。樣品中8 種篩選出農(nóng)藥的一級提取離子流色譜圖見圖1。使用一級譜圖對篩查出的可疑農(nóng)藥根據(jù)同位素分布和精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行匹配分析。如果一級譜圖信息匹配成功，再根據(jù)二級碎片信息進(jìn)行匹配。通過ChemDraw Ultra 12.0軟件繪制可疑農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)式，并將其導(dǎo)入PeakView 2.0軟件中，將結(jié)構(gòu)與二級碎片進(jìn)行匹配，結(jié)合相應(yīng)的檢索匹配得分值判斷目標(biāo)化合物是否檢出（表3）。

圖1 8 種篩選出農(nóng)藥的提取離子流色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of eight selected pesticides

表3 8 種篩選出農(nóng)藥的保留時間和質(zhì)譜信息Table 3 Retention time and mass spectral information of eight pesticides

以嘧菌酯篩查為例，建立非靶向篩查農(nóng)藥的分析方法時，將其分子式輸入篩查列表中，并定義離子化模式為[M+H]+，得到的提取離子流色譜圖見圖2A，可知嘧菌酯的精確質(zhì)量數(shù)誤差為0.31 mDa，小于高分辨質(zhì)譜允許的誤差5 mDa。母離子同位素分布見圖2B，同位素比值與嘧菌酯理論同位素分布匹配度為98.5%。調(diào)用其二級質(zhì)譜圖，結(jié)合其結(jié)構(gòu)式進(jìn)行結(jié)構(gòu)與二級精確質(zhì)量數(shù)的匹配，結(jié)果見圖2C，嘧菌酯的3 個豐度最大的碎片與結(jié)構(gòu)完全匹配，3 個碎片精確質(zhì)量數(shù)誤差小于0.000 1 Da。由此判斷樣品中的農(nóng)藥為嘧菌酯。為了驗(yàn)證篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性，對嘧菌酯的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間、一級精確質(zhì)量數(shù)、一級同位素分布、二級碎片信息與樣品中篩查出的農(nóng)藥完全吻合，證明了該方法的可靠性。

圖2 嘧菌酯篩查分析圖Fig. 2 Screening and analysis of azoxystrobin

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍和定量限

配制8 種農(nóng)藥在荔枝花、蜂巢和蜂蜜中的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積y為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度x（μg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，各農(nóng)藥在1～1 000 μg/L范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以3 倍信噪比確定方法的檢出限，以實(shí)際添加最低質(zhì)量濃度確定方法的定量限，8 種農(nóng)藥的檢出限為0.03～0.5 μg/kg，定量限為0.4～0.8 μg/kg。

2.3.2 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在1、10 μg/kg和100 μg/kg的添加量下8 種農(nóng)藥在荔枝花、蜂巢和蜂蜜中的平均加標(biāo)回收率分別為80%～95%、81%～95%和81%～96%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2%～5.0%、1.5%～4.1%和1.2%～6.1%，符合殘留分析檢測要求（表4）。

2.4 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

對某地區(qū)4 個荔枝園內(nèi)的荔枝花、蜂巢和蜂蜜樣品進(jìn)行篩查和定量分析（表5），結(jié)果顯示每個果園樣品均有農(nóng)藥檢出，檢出頻次較多的農(nóng)藥有苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯和除蟲脲。我國暫未規(guī)定蜂蜜中上述農(nóng)藥的最大殘留限量，歐盟規(guī)定蜂蜜中苯醚甲環(huán)唑最大殘留限量為0.05 mg/kg，除蟲脲最大殘留限量為0.05 mg/kg，實(shí)際荔枝蜜樣品檢測值均低于歐盟標(biāo)準(zhǔn)。

表5 荔枝花、蜂巢和蜂蜜樣品實(shí)測結(jié)果Table 5 Results of analysis of pesticide residues in litchi flower, hive and honey by HPLC-Q-TOF-MS μg/kg

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了QuEChERS與HPLC-Q-TOF-MS法快速篩查與確證荔枝花、蜂巢和蜂蜜中的多種農(nóng)藥殘留痕量分析方法，該方法在樣品基質(zhì)復(fù)雜以及無標(biāo)準(zhǔn)品條件下，可根據(jù)一級TOP-MS和二級IDA-MS信息，實(shí)現(xiàn)樣品中農(nóng)藥的鑒定與分析，方法簡便快速、靈敏度高。