刁衛(wèi)平 潘寶貴 郭廣君 高長(zhǎng)洲 高海濤 劉金兵 王述彬*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京210014； 2.江蘇蘇潤(rùn)種業(yè)股份有限公司， 江蘇沛縣 221636）

辣椒作為一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蔬菜作物[1]，在我國(guó)種植面積每年穩(wěn)定在213.33萬(wàn)hm2（3 200萬(wàn)畝），年總產(chǎn)量約6 400萬(wàn)t，種植面積和消費(fèi)量均位居蔬菜榜首[2-3]。辣椒具有種植效益高，成熟周期短的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)成為幫助農(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟(jì)作物，在調(diào)整農(nóng)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)與產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)方面具有重要作用[4-5]。由于工業(yè)污染加劇、過(guò)度施用化肥農(nóng)藥以及農(nóng)業(yè)設(shè)施的快速發(fā)展，土壤鹽漬化程度不斷加劇，已經(jīng)成為我國(guó)設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)普遍存在的問(wèn)題，制約了辣椒產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)健發(fā)展[6]。因此，篩選鑒定優(yōu)異耐鹽種質(zhì)、培育耐鹽新品種對(duì)辣椒產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有非常重要的意義。

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒課題組前期對(duì)辣椒4個(gè)栽培種23份種質(zhì)資源種子萌發(fā)期耐鹽性差異進(jìn)行評(píng)價(jià)后獲得了3份耐鹽和4份敏鹽材料[7]。本研究進(jìn)一步對(duì)前期獲得的13份耐鹽能力不同的辣椒種質(zhì)為試驗(yàn)材料，高濃度的NaCl溶液處理種子后對(duì)種子相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)鹽害率進(jìn)行分析，并利用隸屬函數(shù)法對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期篩選出耐鹽能力強(qiáng)的辣椒種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒課題組前期利用不同濃度NaCl溶液（0、30、60、90、120、150和180 mmol/L）對(duì)辣椒4個(gè)栽培種23份辣椒種質(zhì)進(jìn)行萌發(fā)期耐鹽性差異分析及評(píng)價(jià)[7]。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上選取其中不同耐鹽性的辣椒種質(zhì)13份（表1），由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒課題組提供。

表1 13 份辣椒種質(zhì)資源信息Table 1 Information of thirteen pepper germplasm resources

1.2 材料處理

每份試驗(yàn)材料挑選大小一致、熟籽粒飽滿的種子600粒，用5%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行20 min消毒，再用純凈水反復(fù)沖洗干凈后待用。取直徑為9 cm的培養(yǎng)皿，覆蓋兩層濾紙，將種子置于濾紙上，用不同濃度的NaCl溶液（180、210、240、270、300、330、360、390、420 mmol/L）處理，用純水為對(duì)照處理。每組處理重復(fù)3次，每次重復(fù)20粒，均勻排列；每個(gè)培養(yǎng)皿加入5 mL不同濃度的NaCl溶液或純凈水。培養(yǎng)皿置于人工氣候室，在（28±1）℃黑暗條件下處理發(fā)芽，隔兩天更換濾紙和溶液，保持溶液濃度恒定[7]。

1.3 指標(biāo)測(cè)量和計(jì)算

每天于相同時(shí)間觀察種子的出芽情況，以胚根突破種皮長(zhǎng)度達(dá)到種子直徑的1/2作為發(fā)芽標(biāo)志，記錄種子的發(fā)芽數(shù)。以6 d的發(fā)芽數(shù)計(jì)算相對(duì)發(fā)芽勢(shì)；以第14 d的發(fā)芽數(shù)計(jì)算相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)鹽害率[8]。相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率(%)＝(發(fā)芽粒數(shù)/供試粒數(shù))×100；

相對(duì)發(fā)芽率(%)＝鹽處理發(fā)芽種子數(shù)/對(duì)照發(fā)芽種子數(shù)×100；

相對(duì)發(fā)芽勢(shì)(%)＝鹽處理初期的發(fā)芽種子總數(shù)/對(duì)照初期發(fā)芽種子總數(shù)×100；

相對(duì)發(fā)芽指數(shù)(%)＝鹽處理發(fā)芽指數(shù)/對(duì)照發(fā)芽指數(shù)×100；

發(fā)芽指數(shù)＝∑(Gt/Dt)。其中：Gt為t日的發(fā)芽數(shù)；Dt為日數(shù)；

相對(duì)鹽害率(%)＝［（對(duì)照發(fā)芽率－處理發(fā)芽率）/對(duì)照發(fā)芽率］×100。

S50%值為相對(duì)發(fā)芽率達(dá)到50%時(shí)的鹽度S（mmol/L）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010和DPS9.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析，差異顯著性測(cè)驗(yàn)采用Tukey法。隸屬函數(shù)值計(jì)算參照高晶霞等[9]的方法，試驗(yàn)指標(biāo)的脅迫指數(shù)＝脅迫下指標(biāo)值/對(duì)照指標(biāo)值。聚類分析采用歐氏距離類平均法(UPGMA)。

當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)與耐鹽性呈正相關(guān)關(guān)系時(shí)，耐鹽隸屬函數(shù)值的計(jì)算公式為：

當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)與耐鹽性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系時(shí)，通過(guò)反隸屬函數(shù)計(jì)算其脅迫隸屬函數(shù)值，公式為：

上式中：X′ij表示i品種的j指標(biāo)的耐鹽隸屬函數(shù)值；Xjmax為各品種j指標(biāo)的最大值；Xjmin為各品種j指標(biāo)的最小值[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高鹽脅迫對(duì)辣椒材料相對(duì)發(fā)芽率的影響

從表2可看出，隨著鹽濃度升高，所有試驗(yàn)材料相對(duì)發(fā)芽率都呈緩慢下降趨勢(shì)，說(shuō)明鹽脅迫對(duì)辣椒種子發(fā)芽具有抑制作用。其中1號(hào)敏鹽材料完全不能正常發(fā)芽，表明其對(duì)高鹽處理很敏感。2號(hào)敏鹽材料的相對(duì)發(fā)芽率在270 mmol/L高鹽處理下已不到10 %（P＜0.01），而11和13號(hào)耐鹽材料的相對(duì)發(fā)芽率仍能高達(dá)90%以上。在180、210 mmol/L高鹽濃度條件下，發(fā)現(xiàn)7、9、10、11、12、13號(hào)耐鹽材料的相對(duì)發(fā)芽率都維持在90 %以上（P＞ 0.05）， 可 當(dāng) NaCl濃 度 達(dá) 到 240 mmol/L時(shí)，發(fā)現(xiàn)7和9號(hào)耐鹽材料的相對(duì)發(fā)芽率分別由93.33%和91.48%急速下降至61.67%和74.26%（P＜0.01）。此外，對(duì)耐鹽種質(zhì)10、11、12、13號(hào)繼續(xù)加大鹽濃度處理后發(fā)現(xiàn)，在NaCl濃度為360 mmol/L條件下時(shí)，11、13號(hào)耐鹽材料的相對(duì)發(fā)芽率仍達(dá)到50 %以上。通過(guò)觀察S50%值，發(fā)現(xiàn)這4份種質(zhì)的S50%值均超過(guò)300 mmol/L，其中11和13號(hào)的S50 %值分別為379.26和369.67 mmol/L，說(shuō)明這2份種質(zhì)具有超強(qiáng)耐鹽性。

表2 高鹽處理對(duì)不同辣椒材料相對(duì)發(fā)芽率的影響Table 2 Effect of high salt treatment on relative germination rate of different pepper varieties

2.2 高鹽脅迫對(duì)辣椒材料相對(duì)發(fā)芽勢(shì)的影響

從表3可看出，隨著鹽濃度升高，所有材料相對(duì)發(fā)芽勢(shì)都呈顯著下降的趨勢(shì)，說(shuō)明辣椒種子萌發(fā)受到高鹽脅迫的顯著抑制。不同辣椒種質(zhì)對(duì)高鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)理相似，1號(hào)敏鹽材料不能發(fā)芽。在210 mmol/L高鹽濃度處理下，2號(hào)敏鹽材料相對(duì)發(fā)芽勢(shì)僅為3.7 %（P＜0.01），而11、12和13號(hào)耐鹽材料的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)仍維持在80 %以上（P＞0.05）。當(dāng)鹽濃度增加到240 mmol/L時(shí)，9號(hào)材料相對(duì)發(fā)芽勢(shì)相比210 mmol/L鹽濃度時(shí)下降幅度高達(dá)95.6 %（P＜0.01），12、13號(hào)材料相對(duì)發(fā)芽勢(shì)下降幅度分別為48.8 %和8.3 %（P＜0.01）。當(dāng)鹽濃度增加到270 mmol/L時(shí)，11、13號(hào)材料的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)仍在70.0%以上（P＞0.05），說(shuō)明11、13號(hào)試驗(yàn)材料對(duì)高鹽脅迫適應(yīng)性強(qiáng)，在較高鹽脅迫下仍具有較高初期發(fā)芽能力，雖然12號(hào)試驗(yàn)材料具有較高相對(duì)發(fā)芽率，但是在較高鹽濃度條件下初期發(fā)芽能力較差。進(jìn)一步對(duì)10、11、12、13號(hào)試驗(yàn)材料提高鹽濃度處理，發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽濃度達(dá)到300 mmol/L時(shí)，所有辣椒種質(zhì)材料種子萌發(fā)初期發(fā)芽能力都受到了強(qiáng)烈的抑制。

表3 NaCl處理對(duì)不同辣椒材料相對(duì)發(fā)芽勢(shì)的影響Table 3 Effect of high salt treatment on relative germination potential of different pepper varieties

2.3 高鹽脅迫對(duì)辣椒材料相對(duì)發(fā)芽指數(shù)的影響

從表4可看出，隨著鹽濃度升高，所有試驗(yàn)材料相對(duì)發(fā)芽指數(shù)都呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，2號(hào)敏鹽材料整體發(fā)芽指數(shù)較低，且下降迅速，在NaCl濃度為240 mmol/L條件下相對(duì)發(fā)芽指數(shù)僅為2.52 %（P＜0.01），而在此高鹽濃度下的10、11、13號(hào)耐鹽材料的相對(duì)發(fā)芽指數(shù)均在60 %以上（P＞0.05）。此外，對(duì)10、11、12、13號(hào)試驗(yàn)材料加大鹽處理濃度后發(fā)現(xiàn)，在360 mmol/L NaCl濃度條件下，11、13號(hào)材料相對(duì)發(fā)芽指數(shù)仍在10 %以上。通過(guò)觀察S50%值，發(fā)現(xiàn)4份種質(zhì)的S50 %值均在240 mmol/L以上，其中11、13號(hào)的S50%值分別為254.84、279.87 mmol/L，說(shuō)明這2份種質(zhì)在高鹽條件下具有較高的活力和耐鹽性。

表4 高鹽處理對(duì)不同辣椒材料相對(duì)發(fā)芽指數(shù)的影響Table 4 Effect of high salt treatment on relative germination index of different pepper varieties

2.4 高鹽脅迫對(duì)辣椒材料相對(duì)鹽害率的影響

相對(duì)鹽害率可反映種子萌發(fā)階段的耐鹽程度，數(shù)值越高，試驗(yàn)材料耐鹽性越差。從表5可以看出，隨著鹽濃度的升高，試驗(yàn)材料的相對(duì)鹽害率總體呈逐漸增加的趨勢(shì)，且不同試驗(yàn)材料對(duì)鹽脅迫響應(yīng)機(jī)理不同。1號(hào)敏鹽試材相對(duì)鹽害率在NaCl濃度為180 mmol/L時(shí)達(dá)到100 %（P＞0.05）。鹽濃度240 mmol/L條件下，2號(hào)敏鹽材料的相對(duì)鹽害率高達(dá)91.32 %（P＜0.01），但耐鹽性強(qiáng)的10、11、12、13號(hào)這4份材料的相對(duì)鹽害率均在10 %以下（P＞0.05），其中11號(hào)試驗(yàn)材料相對(duì)鹽害率僅為3.67 %，說(shuō)明敏鹽和耐鹽材料在鹽脅迫耐受性有顯著差異。

從表5中還可看出，對(duì)于2、4、7、9號(hào)試驗(yàn)材料，當(dāng)NaCl濃度從210 mmol/L增加到240 mmol/L時(shí)，相對(duì)鹽害率迅速上升（P＜0.01），但是耐鹽性強(qiáng)的試驗(yàn)材料相對(duì)鹽害率仍可以在低范圍內(nèi)保持平衡。此外，進(jìn)一步加大鹽處理濃度后發(fā)現(xiàn)，10、11號(hào)試材在NaCl濃度為360 mmol/L條件下仍能維持低于50%的相對(duì)鹽害率，而12、13號(hào)試材在NaCl濃度由330 mmol/L增加到360 mmol/L過(guò)程中相對(duì)鹽害率呈快速上升的趨勢(shì)（P＜0.01），說(shuō)明不同耐鹽種質(zhì)在耐鹽脅迫方面也有不同的具體特點(diǎn)。

表5 NaCl處理對(duì)不同辣椒材料相對(duì)鹽害率的影響Table 5 Effect of high salt treatment on relative rate of salt injury of different pepper varieties

2.5 不同辣椒種子發(fā)芽期耐鹽性相關(guān)指標(biāo)差異分析

對(duì)13份辣椒種質(zhì)材料的相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)鹽害率4個(gè)耐鹽指標(biāo)兩兩進(jìn)行相關(guān)性分析（表6），發(fā)現(xiàn)4個(gè)指標(biāo)之間均存在不同程度的極顯著（P＜0.01）相關(guān)關(guān)系。其中，相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)3個(gè)指標(biāo)間互為極顯著正相關(guān)關(guān)系，相對(duì)鹽害率與其他3個(gè)指標(biāo)間互為極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。辣椒的耐鹽能力受到多基因協(xié)調(diào)控制，為了更準(zhǔn)確真實(shí)的反應(yīng)辣椒種質(zhì)材料的耐鹽性，還需對(duì)4個(gè)耐鹽指標(biāo)進(jìn)行綜合分析。

表6 鹽脅迫下辣椒種子萌發(fā)不同耐鹽指標(biāo)間的相關(guān)分析Table 6 Correlation analysis of different salt tolerance indexes of pepper seed germination under salt stress

2.6 辣椒種子萌發(fā)期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

隨著鹽濃度的升高，發(fā)現(xiàn)不同辣椒種質(zhì)材料間耐鹽性存在明顯差異，采用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法對(duì)13份辣椒種質(zhì)材料的4個(gè)耐鹽指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，計(jì)算出隸屬函數(shù)平均值，進(jìn)行排名（表7）。平均隸屬函數(shù)值越大，說(shuō)明該辣椒種質(zhì)越耐鹽，反之則不耐鹽。由表7可知，鹽脅迫下辣椒材料各指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值范圍在0～0.83之間，根據(jù)平均隸屬函數(shù)值大小排列，13號(hào)種質(zhì)材料排在第1位，綜合耐鹽能力最強(qiáng)；1號(hào)種質(zhì)材料排在末位，綜合耐鹽能力最弱。

表7 鹽脅迫下辣椒材料各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值及排序Table 7 Membership function value and rank of each index of pepper under salt stress

2.7 13份辣椒材料耐鹽性聚類分析

在180～420 mmol/L高鹽濃度處理下，以13份辣椒材料的平均隸屬函數(shù)值為基礎(chǔ)，采用類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。如圖1所示，在歐式距離0.65處可將試驗(yàn)材料分為三大類，第Ⅰ類包含11、13號(hào)2份種質(zhì)材料，屬于極耐鹽材料；第Ⅱ類包括3、4、5、6、7、8、9、10、12號(hào)9份種質(zhì)材料，歸為耐鹽性強(qiáng)材料；第Ⅲ類包括1、2號(hào)2份種質(zhì)材料，屬于敏鹽性材料。

圖1 辣椒種質(zhì)資源耐鹽性聚類分析Fig.1 Salt tolerance clustering analysis of pepper germplasm resources

3 討論

目前蔬菜作物芽期耐鹽性鑒定指標(biāo)主要有發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、萌發(fā)活力指數(shù)和相對(duì)萌發(fā)活力指數(shù)等。前期課題組對(duì)辣椒4個(gè)栽培種23份種質(zhì)材料進(jìn)行了耐鹽性初步研究[7]，本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上以13份辣椒耐鹽能力不同的種質(zhì)為試驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行180、210、240、270、300、330、360、390 和 420 mmol/L 一系列高鹽處理。結(jié)果表明隨著鹽濃度的增加，辣椒種質(zhì)的發(fā)芽率越來(lái)越低，高鹽脅迫能明顯抑制種子發(fā)芽，但不同辣椒材料在高鹽處理下的發(fā)芽情況存在很大差異。本試驗(yàn)篩選到2份耐鹽特異辣椒種質(zhì)PI201224和PI201239，它們?cè)?70 mmol/L高鹽濃度處理下，相對(duì)發(fā)芽勢(shì)仍能達(dá)到70.00 %以上，說(shuō)明它們對(duì)高鹽脅迫適應(yīng)性強(qiáng)，具有較好的初期發(fā)芽能力。同時(shí)，PI201224和PI201239的相對(duì)發(fā)芽率S50%分別達(dá)到369.67和379.26 mmol/L，說(shuō)明它們?cè)诟啕}條件下具有較高的發(fā)芽能力和極強(qiáng)的耐鹽能力，這兩份材料是目前現(xiàn)有報(bào)道中最耐鹽的辣椒種質(zhì)。

大量研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)具有抑制作用[11-12]。李妍等[13]認(rèn)為高鹽抑制種子萌發(fā)可能是由于高濃度Na+產(chǎn)生的毒害作用；陸怡等[14]認(rèn)為高鹽抑制種子萌發(fā)也可能是由于Na+過(guò)高抑制了根系對(duì)K+、Ca+等的吸收，引起滲透脅迫，造成細(xì)胞膜損傷，干擾植物的正常生長(zhǎng)。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，不同植物或植物不同品種對(duì)鹽脅迫的敏感程度和耐鹽能力也不同[15]。顧閩峰等[16]用不同濃度的NaCl處理了8個(gè)辣椒品種，結(jié)果表明，在不同濃度NaCl處理下，辣椒不同品種間種子萌發(fā)差異顯著。本試驗(yàn)研究結(jié)果與顧閩峰等的研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)利用隸屬函數(shù)法和聚類分析對(duì)13份辣椒種質(zhì)材料進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，在歐式距離0.65處將13份種質(zhì)材料分為3類，在180～420 mmol/L鹽脅迫處理下，極耐鹽材料（Ⅰ）包括PI201224和PI201239；耐鹽性強(qiáng)材料（Ⅱ）包括PI585251、PI357486、Grif9108、PI201248、PI368435、Grif9238、2017D083、PI241650和 PI339033；敏鹽材料（Ⅲ）包括PI438643和PI640902。為了更加全面反映辣椒種質(zhì)材料的耐鹽能力，還需要進(jìn)一步對(duì)不同生長(zhǎng)階段的耐鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià)與比較。