朱日然,牛水蛟,劉 瑩,張先勤,李啟艷,林鈺鎵*
(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 濟(jì)南250012;2. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局 化妝品原料質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250101;3. 濟(jì)南市歷下區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育監(jiān)督所,山東 濟(jì)南 250021)
西洋參,五加科人參屬植物西洋參(Panax quinquefolium L.)的干燥根[1],最初生長(zhǎng)于北美洲原始森林中,主產(chǎn)于加拿大和美國(guó),后經(jīng)引進(jìn),在我國(guó)遼寧、山東、吉林、北京等地廣泛種植[2]。西洋參性涼、味甘、微苦,補(bǔ)氣養(yǎng)陰性能極佳,在治療陰虛津傷、氣陰兩虛等方面較人參更為柔和,適宜于中老年及身體虛弱人群食用[3]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),西洋參作為臨床貴重藥材之一,在提高免疫力、抗癌、降血糖等方面有顯著功效[4]。但作為一種外來(lái)名貴藥材,西洋參同樣面臨多種病害的威脅,如西洋參1~2年生上立枯病、拌倒病的發(fā)病率較大,在3~4年生上黑斑病、白粉病的發(fā)病率較大[5]。莊緒靜等[6]采用腐霉利對(duì)西洋參病害進(jìn)行防治,得到了較好的效果。
腐霉利(速克靈、二甲菌核利),國(guó)際通用名:Procymidone,化學(xué)名稱:N-(3,5-二氯苯胺)-1,2-二甲基環(huán)丙烷-1,2-二羰基亞胺,結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1,是一類環(huán)酰亞胺類農(nóng)用內(nèi)吸性殺菌劑,于1972年由日本住友化學(xué)株式會(huì)社研制成功。主要通過(guò)抑制菌體內(nèi)甘油三酯合成,達(dá)到保護(hù)和治療農(nóng)作物病害的雙重作用[7]。
圖1 腐霉利結(jié)構(gòu)式
然而作為一種有機(jī)氯農(nóng)藥,腐霉利對(duì)人體和土壤環(huán)境均有一定危害,因此,歐盟和美國(guó)等國(guó)家或地區(qū),相繼對(duì)進(jìn)口食品中的腐霉利殘留量提出了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn),如歐盟規(guī)定果蔬中腐霉利的最大殘留限量(maximum residue limit,MRL)值為0.02 mg/kg,美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)和加拿大規(guī)定葡萄酒中腐霉利的MRL值分別為0.2 mg/kg和1.0 mg/kg,日本實(shí)行的“肯定列表制度”中有關(guān)食品限量的暫定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定腐霉利的MRL值為0.02 mg/kg,而對(duì)于其他在暫定標(biāo)準(zhǔn)以外的農(nóng)業(yè)品實(shí)行“一律標(biāo)準(zhǔn)”,即0.01 mg/kg[8],我國(guó)也制定了蔬菜和油脂等產(chǎn)品中腐霉利殘留的限量標(biāo)準(zhǔn)[9]。
目前腐霉利殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[10]、熒光光譜法[11]、高效液相色譜法[12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]等。前處理方法主要有固相萃取法[14]、基質(zhì)固相分散萃取[15]、QuEChERS法[16]等。QuEChERS法是一種較新穎的前處理方法,具有分析速度快,溶劑使用量少,簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì),可簡(jiǎn)化繁雜的凈化步驟。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)具有定性、定量準(zhǔn)確,靈敏度高,線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用乙腈提取,QuEChERS凈化,外標(biāo)法定量,GC-MS法測(cè)定西洋參中腐霉利的殘留量,以期建立一種快速檢測(cè)西洋參中腐霉利殘留量的分析方法。
Thermo TRACE 1300-ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛公司);Mettler Toledo MS 電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);Milli-Q超純水機(jī)(Millipore有限公司); Universal320R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。
QuEChERS萃取鹽包(4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g檸檬酸鈉+0.5 g檸檬酸氫二鈉);QuEChERS凈化管15 ml(400 mg PSA+400 mg C18+1200 mg MgSO4)。
腐霉利對(duì)照品,純度99.8 %,批號(hào)B0003652,Be Pure公司;甲苯、乙酸乙酯、乙腈等有機(jī)溶劑均為分析純;QuEChERS快速凈化小柱。
色譜柱:DB-5MS,30 m×0.25 mm×0.25 μm;載氣:氦氣,純度≥ 99.999 %;恒流流速:1.00 ml/min;進(jìn)樣方式:不分流;離子源:EI源,離子源溫度:230 ℃;電離能量:70 eV;色質(zhì)接口溫度:250 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;進(jìn)樣量:1 μl,溶劑延遲:8 min。
升溫程序:100 ℃保持1 min,以15 ℃/min速率升溫至280 ℃,然后保持15 min,運(yùn)行總時(shí)間28 min。
測(cè)定方式:全掃描和選擇離子監(jiān)測(cè)同時(shí)采集模式。全掃描離子(m/z):50-300;監(jiān)測(cè)離子(m/z):96,254,283,285;定量離子:m/z 285。
稱取西洋參粉末(過(guò)三號(hào)篩)2.0 g置入50 ml具塞離心管中,先加入水10 ml渦旋混勻,再加入乙腈10 ml和QuEChERS萃取鹽包,用力振搖1 min,4000 r/min離心5 min。先用2 ml甲苯預(yù)飽和凈化管,混勻凈化管,取6 ml乙腈層加入凈化管中,渦旋混勻后4000 r/min離心3 min,然后取上清4 ml 40 ℃氮?dú)獯蹈?,加丙? ml復(fù)溶后,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,濾液待測(cè)定。
吸取一定量腐霉利對(duì)照品(in acetone)置入10 ml量瓶,用丙酮逐級(jí)稀釋并定容得到0.5,1.0,2.5,5.0,10 μg/ml的腐霉利系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,上機(jī)測(cè)定。
在上述儀器條件下,分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品進(jìn)行測(cè)定,得其保留時(shí)間為14.59 min,豐度比m/z 96: 254: 283: 285 = 100: 3: 37: 23,見(jiàn)圖2、圖3。
圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖及選擇離子流圖
圖3 樣品溶液的總離子流圖及選擇離子流圖
2.1.1 線性范圍、檢出限和定量限 測(cè)定“1.4”項(xiàng)中的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以面積對(duì)濃度作圖,濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí),將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋并測(cè)定,以S/N=3時(shí)的濃度計(jì)算檢出限,以S/N=10時(shí)的濃度計(jì)算定量限,結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 腐霉利保留時(shí)間、線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
2.1.2 回收率 按“1.2”項(xiàng)方法對(duì)空白樣品進(jìn)行低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每水平各測(cè)定6份,分別計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
2.1.3 穩(wěn)定性 取濃度為5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)腐霉利進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試,按上述儀器條件分別在0,2,4,8,12,24 h進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)測(cè)定的目標(biāo)化合物峰面積計(jì)算RSD為1.99 %,表明該成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.4 日內(nèi)和日間精密度 取濃度為5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)腐霉利進(jìn)行精密度研究,于一日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算峰面積日內(nèi)精密度RSD為0.86 %;連續(xù)進(jìn)樣3天,每天6次,計(jì)算3天的峰面積日間精密度RSD為1.66 %,表明日內(nèi)及日間精密度結(jié)果均良好。
2.1.5 重復(fù)性 取一批樣品,精密稱定6份,按“1.3”項(xiàng)法制備,按上述儀器條件分別進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)測(cè)定的目標(biāo)化合物濃度計(jì)算RSD,結(jié)果為2.09 %,表明該方法重復(fù)性良好。
本研究共收集不同產(chǎn)地的西洋參藥材35批,采用上述方法對(duì)該35批樣品進(jìn)行前處理并測(cè)定,每批樣品平行測(cè)定2份,結(jié)果表明,共有10批藥材檢出腐霉利,濃度為1.06~3.73 mg/kg。
QuEChERS法有多種提取溶劑,常用的有乙腈、乙酸乙酯、丙酮等,三者對(duì)有機(jī)化合物提取效果略有不同。本實(shí)驗(yàn)選用乙腈作為提取溶劑,主要有以下3個(gè)原因:(1)丙酮與水的互溶度較大,可能導(dǎo)致待測(cè)組分的回收率降低;(2) 提取弱極性的化合物時(shí)可選用乙酸乙酯,而對(duì)于較強(qiáng)極性的成分,乙酸乙酯提取效果不佳;(3)腐霉利結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)內(nèi)酰胺鍵,極性較大,適合用乙腈提取,且乙腈對(duì)脂肪和色素的溶解性相較丙酮和乙酸乙酯最低,故選擇乙腈作為提取溶劑。
QuEChERS法是一種新穎的樣品前處理技術(shù),最初主要用于蔬菜水果樣品中的農(nóng)藥殘留分析,隨著研究的深入,QuEChERS法已擴(kuò)展應(yīng)用到諸多領(lǐng)域。相對(duì)于傳統(tǒng)的前處理方法,QuEChERS法是向提取液中加入硫酸鎂等干燥劑和碳18等雜質(zhì)吸附劑,簡(jiǎn)化了樣品的前處理步驟,提高了前處理工作效率,降低了實(shí)驗(yàn)中各因素誤差。
常用鹽析試劑組合是醋酸鈉和檸檬酸鈉兩種體系,本研究選擇了含有4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉的緩沖鹽體系,其中無(wú)水硫酸鎂用于除去基質(zhì)中的水分,其余的緩沖鹽用于提供適宜的pH用于保證一些對(duì)酸堿敏感的農(nóng)藥可以有好的回收率。
常用的吸附劑有PSA/C18/GCB等,其中C18和GCB主要清除脂類和色素等非極性物質(zhì),PSA通過(guò)極性、陰離子交換作用力吸附除去極性較強(qiáng)的雜質(zhì),如糖類、脂肪酸、有機(jī)酸、多酚等。由于西洋參藥材成分復(fù)雜,在前處理時(shí)有效地除去非目標(biāo)物質(zhì),可防止假陽(yáng)性的產(chǎn)生,本研究選擇PSA 400 mg + C18400 mg作為吸附劑。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)采用乙腈作為提取溶劑,經(jīng)QuEChERS 方法提取、凈化西洋參中的腐霉利,選取 PSA 400 mg + C18400 mg作為吸附劑,對(duì)西洋參中殘留腐霉利進(jìn)行GC-MS分析。結(jié)果表明,GC-MS法測(cè)定西洋參中的腐霉利快速簡(jiǎn)便,重復(fù)性和靈敏度均較好,在對(duì)市場(chǎng)中西洋參的腐霉利殘留量進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí),也可為中藥西洋參市場(chǎng)監(jiān)督提供一定的技術(shù)支持。