胡藝偉,李大露,席浩淳,何永軍,陳火英,劉 楊

(上海交通大學農業(yè)與生物學院,上海 200240)

花青素是一種天然的類黃酮水溶性色素,在自然界中廣泛分布,目前已知有近30個科的被子植物中含有花青素[1]?；ㄇ嗨鼐哂凶吭降目寡趸?其抗氧化機制是清除自由基,以避免過多的自由基對機體造成損害[2]。此外,花青素還具有抵御癌癥、降低血糖等生理功能[3-4]。茄子是少有的紫色蔬菜,其果肉營養(yǎng)豐富,含有可溶性糖、脂肪、蛋白質、維生素及鐵、磷等多種營養(yǎng)成分。茄子果皮中含有豐富的花青素,茄子中花青素的抗氧化性效果比常見蔬菜作物所含的花青素更佳[5],是人類補充天然花青素的優(yōu)質來源。提高茄子果皮中的花青素含量,可有效提高茄子的營養(yǎng)價值和商品價值。

花青素生物合成途徑網絡由上游的調控基因和下游的結構基因構成,苯丙氨酸經過多步反應轉化成穩(wěn)定的花青素[6],該途徑重要的結構基因包括查爾酮合成酶基因(C HS)和黃烷酮3-羥化酶基因(F3H)等。已有研究證明,SmCHS基因和SmF3H基因在茄子花青素生物合成中具有促進作用[7]。目前對花青素生物合成途徑上游調控基因的研究中,由MYB轉錄因子、bHLH轉錄因子和WD40蛋白組合成的MBW復合體居多,也較為深入。MYB類轉錄因子分為多種類別,其中與花青素合成關系最為密切的是R2R3-MYB轉錄因子。研究表明,GmMYB042基因過表達的煙草植株中,總黃酮量顯著升高,其類黃酮代謝途徑中的多個結構基因的表達量增加[8]。在茄子中,SmMYB1轉錄因子可與花青素合成關鍵酶基因CHS和DFR的啟動子結合,促進花青素合成;COP1是E3泛素連接酶組成的光形態(tài)建成基因,其被認為是一種分子開關,調控植物的光調控發(fā)育[9];SmCOL4蛋白和SmCOL5蛋白都是BBX轉錄因子。BBX轉錄因子屬于鋅指結構蛋白家族,在其氨基酸序列中,具有1—2個B-box基序[10],BBX轉錄因子參與植物的許多生理活動,如植物的光形態(tài)建成、成花過程、響應生物與非生物脅迫以及激素信號轉導等。研究表明,水稻中的BBX蛋白OsCOL15可以通過上調OsGHD7基因或者下調OsR ID1基因的表達影響水稻開花[11];在蘋果中,MdCOL11蛋白為光形態(tài)建成的正向調控因子,其過表達植株下胚軸顯著短于野生型,并且花青素含量顯著增多,說明部分BBX類基因也參與調控植物花青素的生物合成途徑[12]。本研究通過亞細胞定位、酵母雙雜交、酵母單雜交等方法,探究茄子中的目的基因SmCOL5與光調控和花青素合成相關基因的互作情況,以期為提高茄子花青素含量,選育優(yōu)質茄子品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為實驗室保存的茄子種質資源‘藍山禾線’和FGM。‘藍山禾線’為光敏感型茄子,在正常光照條件下生長時,其果皮呈現紫色,在套袋遮光條件下生長則呈現白色。FGM為非光敏型茄子,在正常光照和套袋遮光條件下果皮均呈現紫色。試驗中使用到的大腸桿菌DH5α由北京全式金生物技術有限公司提供;釀酒酵母AH109和根癌農桿菌GV3101由上海唯地生物技術公司提供。

1.2 SmCOL5基因的克隆及表達模式分析

首先對茄子的部分基因進行光響應表達模式分析,通過比較后選取SmCOL5基因作為研究對象。在茄子基因庫網站(http:∕∕eggplant.kazusa.or.jp∕)中獲取SmCOL5基因(Sme2.5_25 982.1_g00 001.1)的序列,使用軟件Primer Premier 5設計引物SmCOL5-F、SmCOL5-R(表1),并委托生工生物工程(上海)公司合成引物。使用日本TaKaRa公司的植物RNA提取試劑盒提取生長5個月的‘藍山禾線’茄子植株根、葉、莖、花和果皮樣品的RNA,采用瓊脂糖電泳和美國Thermo Fisher公司的NanoDrop超微量分光光度計檢測RNA質量與濃度。使用日本TaKaRa公司的反轉錄試劑盒PrimeScript RTMaster Mix合成cDNA,以cDNA為模板擴增SmCOL5基因,再以茄子各組織的cDNA為模板,采用qRT-PCR手段通過引物qRTCOL5-F、qRTCOL5-R(表1)擴增出對應片段并進行熒光檢測,以得到SmCOL5基因的表達量?；蚩寺CR反應程序為:95℃預變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火30 s,72℃延伸20 s,35個循環(huán);6℃保存。qRT-PCR的反應程序為:95℃預變性30 s;95℃變性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,45個循環(huán);溶解曲線分析95℃,10 s;65℃,60 s;97℃,1 s。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the test

1.3 基因及其編碼蛋白的生物信息學分析

所用到的氨基酸序列下載自NCBI網站。利用ExPASy網站(http:∕∕web.expasy.org∕compute_pi∕)預測SmCOL5蛋白的分子量和理論等電點。利用EMBL-EBI(https:∕∕pfam.xfam.org∕search∕sequence)對其結構域進行預測。

1.4 SmCOL5蛋白的亞細胞定位

設計帶有相關同源臂的目的基因的引物,使用日本TaKaRa公司的Prime STARMix試劑盒以cDNA為模板擴增目的片段,使用日本TaKaRa公司的In-Fusion HD Cloning Kit試劑盒對實驗室保存的PHB-YFP載體進行酶切,YFP在特定條件下可以激發(fā)出黃色熒光,可用于檢測與其相連的片段在何處表達。將目的片段用同源重組的方法連接到剪切過的PHB-YFP載體上,將適量上述質粒與GV3101農桿菌液混勻,依次進行冰浴、浸液氮、37℃金屬浴、冰浴,將所得菌液置于搖床培養(yǎng),再采用涂布平板法培養(yǎng)獲得單克隆,挑取單克隆置于含有Rifampicin的培養(yǎng)基中篩選,即可得到帶有目的基因片段的農桿菌,將菌株在28℃條件下于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至適當濃度,然后將菌株懸浮于MS緩沖液中(含有10 mmol∕L MgCl2和10 mmol∕L MES的100 mL MS懸浮液,pH 5.8),黑暗條件下靜置2 h后選取生長1個月的幼嫩煙草葉片,用摘下針頭的1 mL注射器將重組組懸浮液和僅含PHB-YFP載體的懸浮液從葉片背部緩緩注入葉片。2—3 d后使用TCSSP5-II激光共聚焦顯微鏡(Leica,德國)檢測細胞中的YFP信號。

1.5 酵母雙雜交試驗

設計帶有相關同源臂的目的基因SmCOL5和SmCOP1的引物,使用日本TaKaRa公司的Prime STARMix試劑盒以茄子cDNA為模板擴增目的基因片段,將SmCOL5片段用同源重組的方法連接到pGADT7載體上,形成SmCOL5-AD重組體,將SmC OP1基因片段連接到pGBKT7載體上形成SmCOP1-BD重組體。將構建好的帶有SmCOL5基因的質粒與帶有SmCOP1基因的質?；旌?同時設置對照(SmCOL5-AD×BD和SmCOP1-BD×AD),共轉化MATα型AH109酵母感受態(tài)細胞。將轉化后的酵母菌置于SD-Leu-Trp固體培養(yǎng)基(二缺板)中培養(yǎng),2 d后挑取單克隆懸浮后滴于SD-Leu-Trp-His固體培養(yǎng)基(三缺板)、SD-Leu-Trp-His-Ade固體培養(yǎng)基(四缺板)上培養(yǎng),觀察菌落生長情況。

1.6 酵母單雜交試驗

設計帶有相關同源臂的目的基因SmCOL5和結構基因SmF3H、SmCHS啟動子的引物,使用日本TaKaRa公司的Prime STARMix試劑盒以茄子cDNA為模板擴增目的基因片段,將目的片段用同源重組的方法連接到pB42AD載體上,以茄子DNA為模板擴增結構基因啟動子序列,啟動子片段連接到實驗室保存的pLacZi載體上。這是一種含有PCYC1啟動子和LacZ基因的載體,當上游的PCYC1被激活后,促使LacZ基因表達,在X-Gal環(huán)境下,使酵母細胞呈現藍色。將構建好的帶有SmCOL5基因的質粒與帶有結構基因啟動子片段的質粒分別混合,同時設置對照組(Pb42AD-SmCOL5×pLacZi、Pb42AD×pLacZi-SmF3H、Pb42AD×pLacZi-SmCHS以及Pb42AD×pLacZi),然后共轉化MATα型EGY48酵母感受態(tài)細胞,并于SD-TU培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2—3 d后挑取單克隆懸浮后滴于含有X-Gal的定性培養(yǎng)基上培養(yǎng),觀察菌落顏色。

2 結果與分析

2.1 SmCOL5蛋白的生物信息學分析、組織特異性表達及亞細胞定位

光響應表達模式分析表明(圖1),光敏型茄子‘藍山禾線’中SmCOL5蛋白的表達量在茄子開袋后隨光照的變化而變化,其表達量在4 h時達到最高,而SmCOL5蛋白在非光敏型茄子FGM中的表達量相對較低,且變化不明顯,說明SmCOL5蛋白在茄子中的表達由光照誘導。

圖1 SmCOL5蛋白在光敏型茄子(‘藍山禾線’)和非光敏型茄子(FGM)中的表達量變化Fig.1 Expression changes of SmCOL5 protein in photosensitive eggplant(‘Lanshanhexian’)and non photosensitive eggplant(FGM)

生物信息學分析發(fā)現,SmCOL5基因編碼區(qū)長度為1 161 bp,編碼386個氨基酸;經ExPASy網站預測可知,其蛋白分子量為42.48 ku,理論等電點為5.95;Prabi在線預測表明,SmCOL5蛋白由56.72%無規(guī)則卷曲、32.13%α-螺旋、8.85%延伸連和2.30%β-折疊組成。

以成熟茄子的根、莖、葉、花和果皮的cDNA作為模板,通過qRT-PCR進行組織表達特異性分析,發(fā)現SmCOL5蛋白在根、莖、葉、花和果皮中均有表達,在葉中的表達量最高,在根中的表達量最低(圖2)。

圖2 SmCOL5蛋白在茄子不同器官中的表達量Fig.2 Expression of SmCOL5 protein in different organs of eggplant

為了明確目的基因在細胞中的表達情況,將含有PHB-SmCOL5-YFP載體的懸浮液注射于幼嫩煙草葉片的表皮細胞,以含有PHB-YFP載體的懸浮液作為對照,用激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現注射了重組組懸浮液的葉片細胞核發(fā)出黃色熒光,而對照組葉片的細胞質膜和核內均檢測到黃色熒光,表明SmCOL5蛋白定位于細胞核中(圖3)。

圖3 SmCOL5蛋白在煙草葉片中的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of SmCOL5 protein in tobacco leaves

2.2 SmCOL5蛋白與SmCOP1蛋白互作

酵母雙雜交試驗結果表明,帶有pGADT7-SmCOL5與pGBKT7-SmCOP1質粒的酵母在三缺板上可正常生長,在四缺板上也長出了類似單克隆的菌斑,而對照組((SmCOL5-AD×BD和SmCOP1-BD×AD)不論在三缺板還是四缺板上都不能正常生長(圖4),說明SmCOL5蛋白能與SmCOP1蛋白在酵母中互作,即SmCOL5轉錄因子功能受到SmCOP1蛋白的影響,參與到植物的光響應生理活動中。

圖4 SmCOL5蛋白與SmCOP1蛋白酵母雙雜交結果Fig.4 Yeast two-hybrid results of SmCOL5 protein with SmCOP1 protein

2.3 SmCOL5蛋白與SmF3 H、SmCHS基因的啟動子結合

在酵母單雜交試驗中,若調控基因可與結構基因啟動子結合,則共轉化酵母菌菌落將呈現藍色,而對照仍呈現白色。如圖5所示,SmCOL5蛋白與SmF3H、SmCHS基因啟動子混合的菌體均呈現藍色,而對照組(Pb42AD-SmCOL5×pLacZi、Pb42AD×pLacZi-SmF3H、Pb42AD×pLacZi-SmCHS以及Pb42AD×pLacZi)全部呈現白色,說明SmCOL5蛋白可與SmF3H、SmCHS基因的啟動子結合,推測SmCOL5蛋白可能對這2個結構基因的轉錄進行調控,即SmCOL5蛋白可以參與花青素生物合成的調節(jié)。

圖5 SmCOL5蛋白與SmF3 H、SmCHS基因啟動子的酵母單雜交試驗Fig.5 Yeast one-hybrid assay of SmCOL5 protein with promoters of SmF3 H and SmCHS genes

3 討論

BBX基因家族作為植物王國中重要的轉錄因子家族,其基因功能研究主要集中在擬南芥、水稻和蘋果等作物上,研究內容主要包括植物光形態(tài)建成、植物抗性和開花等方面。隨著各界對花青素的關注度日益提高,BBX家族基因影響花青素累積的研究也逐漸增多。在擬南芥中已知的BBX家族基因對花青素累積有影響,如AtBBX21基因參與擬南芥的UV-B光形態(tài)建成,低劑量、長波長的UV-B能誘導植物的花青素累積[13];而在蘋果中,MdBBX20和MdBBX24基因能響應UV-B和溫度的變化,調控蘋果中花青素的累積,從而影響蘋果著色[14];在水稻中,OsBBX14基因可以正調控花青素的生物合成[15]。關于BBX家族基因的研究在其他植物中已經較為常見,但在茄子中卻鮮有研究。本試驗發(fā)現,茄子SmCOL5基因的表達量變化與光照量相關聯,由此可以初步確定其與植物的光形態(tài)建成相關,且SmCOL5蛋白可與SmCOP1蛋白互作,并結合下游調控花青素生物合成的結構基因啟動子,從而可能參與調控茄子中的花青素生物合成途徑。如前述研究,在蘋果的花青素生物合成中,MdBBX20蛋白能特異性識別下游的MdANS基因的啟動子,并促進其表達,這一調控機理與本試驗結果類似。此外,MdBBX37蛋白可與MdMYBs蛋白和MdHY5蛋白互作,共同影響花青素的生物合成[16],這也為研究SmC OL5基因在茄子花青素合成調控中的作用提供了更多的理論依據和方法參照。

為了進一步確定SmC OL5基因參與調控茄子花青素生物合成的機理,后續(xù)將通過設計雙熒光素酶報告、瞬時過表達、穩(wěn)定過表達等試驗來驗證SmCOL5基因的功能,完善茄子花青素合成調控網絡,從而為育成更高花青素含量的茄子奠定堅實基礎。