胡穎雄,王 慧,靳林朋,關(guān) 媛,孫萍東,衛(wèi)季輝,鄭洪建,林金元

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所,上海 201403;2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院CIMMYT-中國(guó)特用玉米研究中心,上海201403;3上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海特用玉米工程技術(shù)研究中心,上海 201403;4上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200234)

鮮食玉米是指在乳熟后期和蠟熟初期采摘果穗作食用或加工的玉米,主要包括糯玉米和甜玉米[1-2]。因其豐富的營(yíng)養(yǎng)、良好的適口性,深受消費(fèi)者喜愛(ài)[3-5]。近年來(lái),隨著人們生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的變化,在市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的推動(dòng)下,鮮食玉米生產(chǎn)在我國(guó)發(fā)展迅速,成為我國(guó)特別是東南沿海發(fā)達(dá)地區(qū)廣大民眾消費(fèi)的重要果蔬品種。玉米穗粒腐病是世界上普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重的一種真菌性病害,嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)[6-7]。隨著耕作制度的調(diào)整、品種更換、氣候因素變化等,穗粒腐病在我國(guó)多個(gè)鮮食玉米產(chǎn)區(qū)和制種區(qū)病情嚴(yán)重度不斷升高,病害不斷蔓延擴(kuò)散。

玉米穗腐病病原菌種類繁多,國(guó)內(nèi)外已經(jīng)鑒定出40多種致病菌種,這些致病菌可以單獨(dú)或復(fù)合侵染引起發(fā)病[8-10]。目前已報(bào)道的玉米穗腐病的主要致病菌包括鐮孢菌(Fusariumspp.)、木霉菌(Trichodermaspp.)、青霉菌(Penicilliumspp.)、曲霉菌(Aspergillusspp.)、蠕孢菌(Helminthosporiumspp.)和鏈格孢菌(Alternariaspp.)等,其中鐮孢菌為優(yōu)勢(shì)病原菌[11-15],過(guò)去的研究表明擬輪枝鐮孢菌是我國(guó)玉米穗粒腐病第一大致病菌[16]。通過(guò)分析2016年在海南省主要玉米育種基地采集的玉米穗腐病樣本,進(jìn)行室內(nèi)病原菌分離和鑒定,發(fā)現(xiàn)擬輪枝鐮孢菌為優(yōu)勢(shì)病原菌[17]。2015—2017年在山東省采集的138份玉米穗腐病樣品中檢測(cè)到18種真菌,其中鐮孢屬的擬輪枝鐮孢菌為優(yōu)勢(shì)菌,其次為層出鐮孢菌[18]。2016年和2017年在河南及周邊5省36地市玉米產(chǎn)區(qū)采用隨機(jī)取樣方法,采集到大量典型玉米穗腐病樣本,經(jīng)形態(tài)鑒定和分子鑒定,發(fā)現(xiàn)鐮孢菌是該地區(qū)玉米穗腐病的主要病原菌,其中擬輪枝鐮孢菌為該地區(qū)玉米穗腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌[19]。

將鐮孢菌屬準(zhǔn)確鑒定到種是玉米相關(guān)病害研究的基礎(chǔ)。然而,單純依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定很難準(zhǔn)確區(qū)分鐮孢菌屬下各個(gè)種,即使對(duì)于非常專業(yè)的鐮孢菌分類學(xué)者來(lái)講,有時(shí)也需要借助生物學(xué)和分子生物學(xué)方法來(lái)區(qū)分這些疑難種類[20-21]。目前,根據(jù)TEF-1α基因序列對(duì)鐮孢菌進(jìn)行種的分類鑒定已經(jīng)成為常用手段,國(guó)際上建立了基于TEF-1α基因部分序列的鐮孢菌數(shù)據(jù)庫(kù),使得研究者可以方便地利用其基因序列將菌株鑒定到種[22]。

篩選抗病自交系、選育抗病品種是控制和預(yù)防鮮食玉米穗粒腐病的最根本和最有效的措施[23-24]。前期筆者通過(guò)分離鑒定上海地區(qū)鮮食玉米生產(chǎn)區(qū)的穗粒腐病樣,發(fā)現(xiàn)擬輪枝鐮孢菌是主要的致病菌。本研究利用針刺注射果穗接種法,對(duì)37份不同來(lái)源的鮮食玉米自交系種質(zhì)資源進(jìn)行擬輪枝鐮孢菌的人工接種試驗(yàn),以期從中篩選出遺傳穩(wěn)定的抗病優(yōu)質(zhì)鮮食玉米種質(zhì)資源,為抗穗粒腐病優(yōu)質(zhì)鮮食玉米新品種的選育提供直接親本。

1 材料與方法

1.1 供試材料

37份供試鮮食玉米自交系種質(zhì)的種子均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所玉米生物技術(shù)課題組自交純化繁育而來(lái),種質(zhì)資源及主要果穗農(nóng)藝性狀見(jiàn)表1。供試菌株為擬輪枝鐮孢菌,由本課題組從田間自然發(fā)病的穗粒腐病樣中分離鑒定而得。

表1 供試鮮食玉米種質(zhì)資源Table 1 Germplasm resources of the tested fresh maize

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間試驗(yàn)安排

鑒定試驗(yàn)在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗(yàn)站玉米基地進(jìn)行,在試驗(yàn)基地不同的位置設(shè)置3個(gè)鑒定小區(qū),每個(gè)鑒定小區(qū)分別種植供試鮮食甜、糯玉米自交系種質(zhì)材料,行距60 cm,株距25 cm,每份自交系材料種植2行,每行20株。每個(gè)鑒定小區(qū)四周設(shè)1 m寬保護(hù)區(qū),播種前對(duì)供試材料隨機(jī)編號(hào),在玉米整個(gè)生長(zhǎng)期不使用殺菌劑。均人工接種擬輪枝鐮孢菌。

1.2.2 擬輪枝鐮刀菌的分離鑒定

從自然發(fā)病的鮮食玉米穗粒腐病病樣品中剝?nèi)〔〗〗唤缣?—5粒玉米籽粒,將樣本籽粒置于1.5%的次氯酸鈉溶液中浸泡3 min,再利用75%的乙醇溶液處理10 s,滅菌蒸餾水沖洗3次,最后用滅菌的濾紙吸干籽粒表面水分,將處理后的玉米籽粒放置在PDA培養(yǎng)基上,于28℃培養(yǎng)3—5 d,待菌落長(zhǎng)出后,進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化,并在PDA培養(yǎng)基和CLA培養(yǎng)基上進(jìn)行單孢分離培養(yǎng)獲得純化菌株。通過(guò)觀察菌落顏色、形態(tài)等性狀,利用光學(xué)顯微鏡觀察記錄分生孢子的形態(tài)、大小等基本特征,參考魏景超[25]和方中達(dá)[26]的方法對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。

菌株純化培養(yǎng)后,刮取菌絲于研磨器中,加液氮研磨成粉末,提取菌株的基因組DNA。鑒定引物為EF-1F:5’-ATGGGTAAGGA(A∕G)GACAAGAC-3’,EF-1R:5’-GGA(G∕A)GTACCAGT(G∕C)ATCATGTT-3’(引物由上海生工公司合成)。PCR擴(kuò)增體系為25μL,反應(yīng)體系為:DNA模板0.5μL,2×Es Taq MasterMix 12.5μL,上下游引物各0.5μL,ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5 min;95℃變性1 min,53℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,并將PCR目的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)。利用MEGA 5.2軟件進(jìn)行同源樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.3 擬輪枝鐮孢菌的培養(yǎng)

將選取的擬輪枝鐮孢菌4個(gè)不同菌株分別培養(yǎng)于PDA固體培養(yǎng)基上,28℃條件下培養(yǎng)5—7 d,待菌落菌絲長(zhǎng)滿1∕2平板時(shí),4℃條件下保存待用。在接種前取適量玉米雄穗裝入錐形瓶中,雄穗充滿錐形瓶的1∕3—1∕2為宜,在高溫高壓滅菌30 min,連續(xù)滅菌2次,然后在超凈工作臺(tái)中將平板培養(yǎng)基上長(zhǎng)好的4個(gè)擬輪枝鐮孢菌菌落菌株分別接種到滅菌后的錐形瓶?jī)?nèi),用封口膜封好瓶口,28℃條件下培養(yǎng)7—10 d。

1.2.4 接種液的制備

在準(zhǔn)備進(jìn)行人工接種試驗(yàn)前1 d,用無(wú)菌的蒸餾水將錐形瓶?jī)?nèi)已經(jīng)培養(yǎng)好的擬輪枝鐮孢菌分生孢子從雄穗組織上分別洗脫下來(lái),然后用兩層滅菌紗布過(guò)濾,得到孢子懸浮液,分別測(cè)定其濃度,保證選取的4個(gè)擬輪枝鐮孢菌分生孢子濃度為1∶1∶1∶1的配比條件下混合配制擬輪枝鐮孢菌菌液濃度為5×106個(gè)∕mL的懸浮液。在懸浮液中滴入表面活性劑吐溫-80,吐溫-80在懸浮液中的濃度為2μL∕mL,搖勻備用。

1.2.5 人工接種

玉米吐絲后10 d為最佳接種時(shí)期。采用針刺注射果穗接種法,劑量為2 mL,接種后以紙膠帶粘在接種點(diǎn),防止菌液流出,同時(shí)具有保濕效果[27]。接種部位:雌穗中部。接種工具:不銹鋼可調(diào)連續(xù)噴霧注射接菌器。

1.2.6 穗粒腐病抗性分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

性狀調(diào)查采用病情評(píng)級(jí)的標(biāo)準(zhǔn),將抗性等級(jí)分為5級(jí):1、3、5、7、9,其中1為高抗,9為高感(參照《玉米抗病蟲(chóng)性鑒定技術(shù)規(guī)范NY∕T 1248.8—2016》,表2)[28]。性狀調(diào)查時(shí)間為籽粒生理成熟后?？剐缘燃?jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)參照了《玉米抗病蟲(chóng)性鑒定技術(shù)規(guī)范NY∕T 1248.8—2016》:平均病情級(jí)別≤1.5,抗性等級(jí)為高抗(HR);平均病情級(jí)別為1.5<平均病情級(jí)別≤3.5,抗性等級(jí)為抗(R);平均病情級(jí)別為3.5<平均病情級(jí)別≤5.5,抗性等級(jí)為中抗(MR);平均病情級(jí)別為5.5<平均病情級(jí)別≤7.5,抗性等級(jí)為感(S);平均病情級(jí)別為7.5<平均病情級(jí)別≤9.0,抗性等級(jí)為高感(HS)。

表2 抗性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Methods for evaluating resistance

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)病條件下鮮食玉米穗粒腐病原菌侵染癥狀及分布

致病病原菌多從鮮食甜、糯玉米果穗的梢部或中部開(kāi)始向下侵染,在籽粒上或籽粒間產(chǎn)生菌絲體,多呈現(xiàn)白色、粉紅色或褐色,發(fā)病較重時(shí)玉米籽粒褐變或者干癟(圖1)。此外,致病病原菌也會(huì)侵染果穗籽粒的蟲(chóng)蛀部位,使籽粒呈現(xiàn)深褐色,伴隨著白色稀疏霉層,在潮濕環(huán)境下霉層可迅速擴(kuò)散并布滿整個(gè)玉米果穗。

圖1 田間自然發(fā)病條件下的鮮食玉米自交系穗粒腐病果穗樣本Fig.1 The ear rot samples of fresh maize inbred lines under natural field conditions

2.2 擬輪枝鐮孢菌的形態(tài)特征

在采集的鮮食玉米穗粒腐病樣品中,分離獲得擬輪枝鐮孢菌。在PDA培養(yǎng)基中擬輪枝鐮孢菌的氣生菌絲呈現(xiàn)白色叢卷毛狀至毛氈狀(圖2A),隨著菌落培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng),菌絲的顏色由粉色慢慢變成灰紫色,培養(yǎng)基背面菌落色素的顏色也從無(wú)色素,到灰黃色再到暗紫色,最后呈現(xiàn)出黑色。在PDA培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)4 d后,菌落直徑為3.6—4.5 cm。利用CLA培養(yǎng)基進(jìn)行分生孢子的形態(tài)和大小等特征觀察,結(jié)果顯示小型分生孢子較多,呈棒槌形,沒(méi)有或有1分隔(圖2B),在適宜的條件下,小型分生孢子多串生呈鏈狀排列,有時(shí)聚集形成假頭狀(圖2D)。大型分生孢子纖細(xì),為不對(duì)稱的擬紡錘形,背腹兩側(cè)近似平行,略彎曲,壁較薄,基細(xì)胞為不明顯的足跟狀,5—7個(gè)分隔(圖2C)。在形態(tài)學(xué)鑒定過(guò)程中未觀察到厚垣孢子。

圖2 擬輪枝鐮孢菌形態(tài)特征Fig.2 The morphological characteristics of F.verticillioides

2.3 TEF-1α基因序列分析

以EF-1F和EF-1R為引物,利用菌株6-1-1、14-2-2、25-3-1和37-3-2的基因組DNA進(jìn)行目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序,分別得到了大小為687 bp、685 bp、690 bp和686 bp的片段(圖3)。用Blast檢索以上菌株的TEF-1α基因序列,與GenBank中已有的TE F-1α基因序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)菌株6-1-1和25-3-1與GenBank上登記的來(lái)自大西洋中部地區(qū)的擬輪枝鐮孢菌MH496631和MH496632,中國(guó)的KP732009,西班牙的MN861769和MN861768,以及韓國(guó)的HQ622574;菌株14-2-2和37-3-2與丹麥的FN179338親緣關(guān)系較近,序列同源性達(dá)99%。利用MEGA 5.2軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖,結(jié)果表明,菌株6-1-1、14-2-2、25-3-1和37-3-2與以上親緣關(guān)系較近的輪枝鐮孢菌位于同一分支,聚為一類(圖4)。利用TEF-1α基因序列分析證實(shí)本研究中采用形態(tài)學(xué)特征分離鑒定出的擬輪枝鐮孢菌的結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。

圖3 引物EF-1F和EF-1R擴(kuò)增菌株的PCR產(chǎn)物片段Fig.3 The PCR product fragments of pathogen isolates with the primers EF-1F and EF-1R

圖4 菌株6-1-1、14-2-2、25-3-1和37-3-2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of isolates 6-1-1,14-2-2,25-3-1 and 37-3-2

2.4 不同鮮食玉米自交系種質(zhì)資源的穗粒腐病抗性比較

2019年在莊行試驗(yàn)基地三個(gè)不同的區(qū)域分別對(duì)37份鮮食玉米自交系人工接種擬輪枝鐮孢菌,并以3個(gè)區(qū)域抗性評(píng)級(jí)的均值對(duì)玉米穗粒腐病的抗性進(jìn)行了評(píng)價(jià)(圖5,表3)。結(jié)果表明,供試的37份鮮食玉米自交系種質(zhì)在接種擬輪枝鐮孢菌后,其抗性表現(xiàn)差異明顯。Hw53、Hw71、Hw175、Ht219和Ht253共5份自交系對(duì)擬輪枝鐮孢菌表現(xiàn)為高抗玉米穗粒腐病,Hw20、Hw50、Hw51等13份自交系對(duì)擬輪枝鐮孢菌表現(xiàn)為抗玉米穗粒腐病,Ht233、Ht239、Ht245和Ht247共4份自交系對(duì)擬輪枝鐮孢菌表現(xiàn)為中抗玉米穗粒腐病,中抗以上自交系種質(zhì)材料占總體供試自交系的59.46%。在22份糯玉米自交系種質(zhì)中,對(duì)擬輪枝鐮孢菌表現(xiàn)抗病的種質(zhì)有14份,占參試糯玉米自交系種質(zhì)總數(shù)的63.63%;在15份甜玉米自交系種質(zhì)中,對(duì)擬輪枝鐮孢菌表現(xiàn)抗病的種質(zhì)有8份,占參試甜玉米自交系種質(zhì)總數(shù)的53.33%。

表3 鮮食玉米自交系穗粒腐病的抗性鑒定結(jié)果Table 3 The results of resistance evaluation of ear rot in inbred lines of fresh maize

圖5 人工接種條件下部分鮮食玉米果穗抗性鑒定結(jié)果Fig.5 The results of resistance evaluation of ear rot in some inbred lines of fresh maize under artificial inoculation conditions

3 結(jié)論與討論

玉米穗粒腐病是玉米灌漿后期及生產(chǎn)制種中常見(jiàn)的真菌性病害之一,主要以鐮孢菌侵染導(dǎo)致發(fā)病,將鐮孢菌準(zhǔn)確鑒定到種是穗粒腐病害研究的基礎(chǔ)。然而鐮孢菌相近種在形態(tài)學(xué)上差異很小[20-21],通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定鐮孢菌屬各個(gè)種成為研究上的難題。鐮孢菌翻譯延長(zhǎng)因子TEF-1α基因序列表現(xiàn)出廣泛的序列多態(tài)性,其在鐮孢菌屬下各個(gè)種的分類水平上都具有各自的特異性分子標(biāo)記,因而TEF-1α基因序列已成為鐮孢菌進(jìn)行種分類鑒定的常用手段[29-31],因此,本研究在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上,采用TEF-1α基因序列分析作為輔助鑒定手段,提高了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究中選取的菌株6-1-1、14-2-2、25-3-1和37-3-2的TEF-1α基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明,本研究分離鑒定的擬輪枝鐮孢菌與大西洋中部地區(qū),西班牙,韓國(guó),丹麥等地區(qū)分離鑒定出來(lái)的擬輪枝鐮孢菌親緣關(guān)系最近,序列同源性達(dá)99%。這表明擬輪枝鐮孢菌在世界上不同地區(qū)分布廣泛,對(duì)全世界的玉米種植和生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害,而且該菌能產(chǎn)生伏馬毒素(FB)和T-2毒素[32-35]。這些毒素對(duì)于人類健康和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[36-37]。在玉米生產(chǎn)和制種過(guò)程中,一般傳統(tǒng)上采用化學(xué)藥劑來(lái)防治玉米穗粒腐病,不僅防治效率低,并易造成農(nóng)藥污染。因此通過(guò)發(fā)揮植株自身的抗性,選種抗病鮮食玉米品種是穗粒腐病防治最為經(jīng)濟(jì)有效的方法。

鮮食玉米自交系穗粒腐病的抗性鑒定結(jié)果受多種因素的影響。果穗苞葉的厚薄直接影響籽粒感染擬輪枝鐮孢菌的難易程度,從而導(dǎo)致植株果穗籽粒穗粒腐病的抗性差異。甜玉米相對(duì)糯玉米更易感染穗粒腐病,甜玉米和糯玉米在籽粒內(nèi)容物的成分組成上存在較大差異,糯玉米淀粉含量較高,甜玉米的糖成分含量較高,甜玉米和糯玉米籽粒內(nèi)容物組成成分的差異導(dǎo)致在面對(duì)擬輪枝鐮孢菌的侵染時(shí)表現(xiàn)出不同的應(yīng)急免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致植株的抗性出現(xiàn)差異。由于玉米自交系穗粒腐病的抗性鑒定試驗(yàn)受多種因素影響,因此在進(jìn)行穗粒腐病抗性遺傳相關(guān)研究時(shí),應(yīng)建立穩(wěn)定可靠的人工接菌抗性鑒定體系[38]。本研究篩選出5份對(duì)擬輪枝鐮孢菌表現(xiàn)高抗的種質(zhì),分別為Hw53、Hw71、Hw175、Ht219和Ht253。這5份鮮食玉米自交系種質(zhì)可作為抗源,用于鮮食甜、糯玉米穗粒腐病抗性品種選育及其抗性遺傳機(jī)制研究。

本研究中穗粒腐病抗性鑒定的種質(zhì)資源材料大部分具有亞熱帶及溫帶血緣的遺傳背景,遺傳多樣性較豐富,研究結(jié)果顯示這些種質(zhì)材料對(duì)于擬輪枝鐮孢菌具有不同的抗性表現(xiàn)。種質(zhì)資源是玉米抗病育種的基礎(chǔ)物質(zhì),近代玉米育種突破性品種的育成,無(wú)一不取決于優(yōu)異遺傳種質(zhì)資源的發(fā)現(xiàn)和利用。因此需要進(jìn)一步拓展種質(zhì)資源基礎(chǔ),積極引進(jìn)熱帶、亞熱帶的玉米新種質(zhì),同時(shí)利用地方品種種質(zhì)資源,突破因種質(zhì)資源不足而限制玉米抗穗粒腐病育種發(fā)展的瓶頸,進(jìn)而為玉米抗穗粒腐病的品種選育提供堅(jiān)實(shí)的種質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。