陳斌,石榮康,王志城,劉松,李青,劉正文,孫正文,王國(guó)寧,吳金華,馬峙英,張艷,王省芬

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

陸地棉(GossypiumhirsutumL.)作為世界范圍內(nèi)栽培最廣的棉花，占全球棉花總產(chǎn)量的90%以上[1]。黃萎病(Verticillium wilt)是棉花生產(chǎn)中的重要病害，每年造成的皮棉產(chǎn)量損失約占總量的10%～20%[2]。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌 (VerticilliumdahliaeKleb.)引起的土傳維管束病害。大麗輪枝菌寄主范圍廣，能夠侵染多達(dá)600余種雙子葉植物，同時(shí)常會(huì)產(chǎn)生新的致病類型[3]，在土壤中以微菌核的結(jié)構(gòu)存活，使棉花在整個(gè)生育期都可發(fā)病[4]。棉花黃萎病防治難度大，化學(xué)防治常造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，且目前尚無有效的藥物來防治[5]。培育抗病品種仍是防治棉花黃萎病最為經(jīng)濟(jì)有效、綠色環(huán)保的措施，而鑒定挖掘棉花抗病種質(zhì)資源對(duì)于抗病育種具有重要意義。

篩選抗源和選擇抗病后代都必需以抗病鑒定結(jié)果為依據(jù)。陳振聲等[6]鑒定了566個(gè)陸地棉黃萎病抗性，其中抗病及以上的品種占5.83%，耐病品種占23.50%，感病品種占70.70%；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所對(duì)1 512份陸地棉品種進(jìn)行了黃萎病抗性鑒定，抗病品種只占0.80%[7]。目前，黃萎病抗性鑒定方法有田間病圃鑒定、病菌毒素鑒定及室內(nèi)苗期接菌鑒定等[8-12]。田間病圃鑒定是目前應(yīng)用最普遍的鑒定方法[13-15]，但田間鑒定常受到氣候條件不適宜發(fā)病、病圃土壤結(jié)構(gòu)類型不一、病圃病原菌分布不均以及病圃大小無法滿足鑒定材料數(shù)量等多種因素的限制而影響鑒定結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。黃萎病菌毒素鑒定只考慮了毒素對(duì)棉花的毒害作用而沒有考慮病菌的侵染作用，而部分學(xué)者認(rèn)為黃萎病的致病機(jī)制是“堵塞說”[16-17]，因而此方法有待進(jìn)一步探究。苗期室內(nèi)鑒定方法可操作性強(qiáng)，對(duì)鑒定環(huán)境的溫度和濕度可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化控制，同時(shí)可對(duì)棉苗進(jìn)行定點(diǎn)定量的接菌，準(zhǔn)確性強(qiáng)、鑒定效率高，越來越受到學(xué)者們的重視而被廣泛應(yīng)用。

縱觀國(guó)內(nèi)外對(duì)棉花種質(zhì)資源的抗病性鑒定，大多集中在對(duì)鑒定方法和評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究，或者局限在對(duì)個(gè)別單一產(chǎn)棉區(qū)種質(zhì)資源的鑒定。雖然近年來我國(guó)育成的品種黃萎病抗性在不斷提高，但在棉花主產(chǎn)區(qū)黃萎病仍有大面積發(fā)生。目前，對(duì)世界范圍內(nèi)的核心種質(zhì)資源進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)抗性鑒定的研究較少，鑒于我國(guó)陸地棉抗病種質(zhì)資源匱乏且黃萎病日益蔓延的現(xiàn)狀，亟待對(duì)豐富的棉花種質(zhì)資源進(jìn)行抗病性鑒定。本研究擬對(duì)來自國(guó)內(nèi)外主要產(chǎn)棉國(guó)(區(qū))的419份陸地棉核心種質(zhì)進(jìn)行黃萎病抗性鑒定，旨在篩選出一批抗病性好的資源材料，以豐富我國(guó)棉花抗黃萎病資源，為抗黃萎病育種和抗病機(jī)制研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試419份陸地棉核心種質(zhì)資源由本實(shí)驗(yàn)室收集保存[18]，其中，我國(guó)三大棉區(qū)320份、美國(guó)55份、澳大利亞5份、巴基斯坦9份、巴西1份、保加利亞2份、法國(guó)1份、墨西哥1份、日本1份、蘇丹1份、前蘇聯(lián)14份、俄羅斯2份、烏茲別克斯坦1份、土耳其1份、烏干達(dá)3份、西班牙1份、乍得1份。根據(jù)我國(guó)植棉區(qū)域的不同生態(tài)條件以及棉花生產(chǎn)特點(diǎn)，結(jié)合棉產(chǎn)分布現(xiàn)狀和植棉歷史，將我國(guó)棉區(qū)劃分為北部棉區(qū)、黃河流域棉區(qū)、西北內(nèi)陸棉區(qū)、長(zhǎng)江流域棉區(qū)和南部棉區(qū)。將已知育成年代的品種劃分為三類：1970年以前育成的為早期品種，1970—1990年育成的為中期品種，1990年以后育成的為現(xiàn)代品種。所用黃萎病菌系為臨西2-1(LX2-1)，是本團(tuán)隊(duì)于2007年從河北省植棉大縣臨西縣搜集病株，經(jīng)單孢分離獲得的強(qiáng)致病力菌系[19]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1病菌培養(yǎng)與病菌孢子懸浮液的制備 將4 ℃保存的LX2-1接種到PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，然后接種到PDB (potato dextrose broth)培養(yǎng)基中，150 r·min-1震蕩培養(yǎng)7 d，用雙層紗布過濾后，再用滅菌蒸餾水將懸浮液調(diào)至孢子濃度為5×107cfu·mL-1備用。

1.2.2棉苗培養(yǎng)與接菌 抗病性鑒定于2017年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生長(zhǎng)室完成。種子經(jīng)硫酸脫絨處理后，于清水中浸泡過夜后在濕潤(rùn)的4層紗布中催芽過夜，挑選發(fā)芽整齊一致的種子播種于裝有蛭石的六棱缽中[11]。在16 h光照、8 h黑暗，光強(qiáng)6 000～6 500 lx，晝溫28 ℃、夜溫22 ℃，相對(duì)濕度40%～50%的氣候室內(nèi)培育棉苗。

待棉苗第一片真葉完全展開時(shí)，挑選生長(zhǎng)整齊、健壯的棉苗35株，采用本團(tuán)隊(duì)建立的六棱塑料缽定量注射菌液法接種[11]。棉苗接菌后將培養(yǎng)室條件調(diào)整為晝溫25 ℃、夜溫22 ℃，相對(duì)濕度65%～70%，光照條件不變，繼續(xù)培養(yǎng)。其間定期澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液以補(bǔ)充養(yǎng)分。所有供試材料均重復(fù)鑒定3次。

1.2.3病級(jí)調(diào)查 分別在接種后15、20、25 d，采用通用的5級(jí)分類法[19]對(duì)棉苗進(jìn)行病級(jí)調(diào)查：0級(jí)，植株無病癥；1級(jí)，子葉發(fā)病，真葉無病癥；2級(jí)，子葉以上的第一片真葉發(fā)病；3級(jí)，兩片及以上真葉發(fā)病，心葉無病癥；4級(jí)，植株生長(zhǎng)點(diǎn)或整株枯死。

根據(jù)病情指數(shù)(disease index,DI)將品種抗病性劃分為免疫、高抗、抗病、耐病和感病5個(gè)等級(jí)[20]，其對(duì)應(yīng)的病情指數(shù)分別為：DI=0；050.0。

DI=100×∑(各病級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)病級(jí))/(調(diào)查總株數(shù)×4)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

鑒定數(shù)據(jù)設(shè)三次重復(fù)，采用SPSS Statistics 20進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試種質(zhì)資源的抗病性鑒定結(jié)果

分別在不同接種后天數(shù)(days post inoculation，dpi)調(diào)查棉苗病情指數(shù)，發(fā)現(xiàn)419份材料的病情指數(shù)呈正態(tài)分布(圖1)。隨著病菌侵入天數(shù)的延長(zhǎng)，植株病癥急劇增強(qiáng)，在15 dpi，供試材料的平均病情指數(shù)為21.52，最高病情指數(shù)為47.86；20 dpi的平均病情指數(shù)為46.45，最高病情指數(shù)為73.33；而到了25 dpi，平均病情指數(shù)高達(dá)66.46，最高病情指數(shù)達(dá)到了90.00(表1)。感病對(duì)照冀棉11在15 dpi的病情指數(shù)為27.14，20 dpi病情指數(shù)為53.81，25 dpi病情指數(shù)為78.10。以冀棉11的病情指數(shù)超過50(達(dá)到感病)的20 dpi病情指數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行不同材料的抗性分析，發(fā)現(xiàn)資源材料中沒有免疫和高抗的品種，篩選出中植BD13、湯棉7401、寧棉9號(hào)、中1421、魯890、中Arc73、農(nóng)大棉8號(hào)、A41772BBt、遼4853、豫職師84-1、陜2812、中棉所17號(hào)共12份抗病品種(圖2)，占2.86%；耐病材料253份，占60.38%；感病材料154份，占36.75%(圖3)。總體來看，供試種質(zhì)資源的抗病性差異較大，整體抗性水平較差。

圖2 12份抗病材料的病情指數(shù)Fig.2 Disease index of 12 resistant varieties

表1 供試材料病情指數(shù)變異分析Table 1 Variation analysis of disease index for the tested materials

圖1 供試材料在15、20、25 dpi的病情指數(shù)分布Fig.1 Distribution of disease index at 15,20,and 25 dpi

2.2 不同育種時(shí)期種質(zhì)資源抗性比較

對(duì)有育成年代記錄的材料，根據(jù)不同時(shí)期統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，162份現(xiàn)代品種的平均病情指數(shù)為43.75，其中抗病品種7份，所占比例為4.32%；耐病品種113份，占69.75%；感病品種42份，所占比例為25.93%。94份中期品種的平均病情指數(shù)為48.60，其中抗病品種4份，占4.26%；耐病品種50份，占53.19%。42份早期品種的平均病情指數(shù)為51.55，其中抗病品種僅有1份，所占比例為2.38%；耐病品種16份，所占比例為38.10%；其余為感病品種(表2)。結(jié)果表明，在病情指數(shù)以及不同抗病類型所占比例上，現(xiàn)代品種都要好于中期及早期品種。

表2 來自不同育種時(shí)期的資源材料的抗病性表現(xiàn)Table 2 Performance of disease resistance of the accessions from different breeding stages

注：比例尺為4 cm。Note:Scale bars represent 4 cm.圖3 20 dpi核心種質(zhì)中不同抗病類別的表型Fig.3 Different resistance types of cotton germplasm resources at 20 dpi

2.3 不同地理來源種質(zhì)資源抗性比較

分析不同地理來源種質(zhì)資源的病情指數(shù)發(fā)現(xiàn)，黃河流域棉區(qū)的164份材料平均病情指數(shù)為43.21，抗病品種10份，所占比例為6.10%；耐病品種111份，占67.68%；感病品種43份。19份北部棉區(qū)材料的平均病情指數(shù)為43.44，抗病品種有1份，耐病品種14份，所占比例為73.68%；感病品種4份。99份國(guó)外材料的平均病情指數(shù)為46.72，沒有抗病品種；耐病品種62份，所占比例為62.63%；感病品種37份。而其他植棉區(qū)品種的平均病情指數(shù)都高于50.00，并且耐病品種所占比例偏少，感病品種所占比例偏大(表3)。進(jìn)一步對(duì)黃河流域棉區(qū)及北部棉區(qū)的54份現(xiàn)代品種病情指數(shù)進(jìn)行分析，病指均值為40.82，抗病品種6份，占11.11%；耐病品種38份，占70.37%；感病品種10份。結(jié)果表明，不同地理來源的材料在抗性上存在差異，特別是我國(guó)黃河流域和北部棉區(qū)的現(xiàn)代品種的抗性整體要好于其他植棉區(qū)品種的抗性。

表3 不同地理來源資源材料的抗病性表現(xiàn)Table 3 Performance of disease resistance of the accessions from different geographic origins

3 討論

選育和種植抗病品種是防治棉花黃萎病最為經(jīng)濟(jì)有效的方法[21]，近些年來，通過育種家的不斷努力已經(jīng)培育出了農(nóng)大601、中棉所49、魯棉研28等黃萎病抗性較好的品種，這些品種在生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用[22-24]。但隨著時(shí)間的推移，病菌不斷發(fā)生變異，因此需要育種家不斷地培育抗病棉花新品種。但目前研究者對(duì)棉花抗黃萎病機(jī)制的認(rèn)識(shí)還比較薄弱，而且育種家缺乏遺傳變異豐富且抗黃萎病的優(yōu)異種質(zhì)資源[25]。目前，我國(guó)棉花種質(zhì)中期庫(kù)共保存著來自世界50多個(gè)產(chǎn)棉國(guó)的8 000多份種質(zhì)[26-27]，但其中絕大部分對(duì)棉花黃萎病的抗性水平尚不明確。為探明資源材料對(duì)黃萎病的抗性，為棉花抗黃萎病育種提供優(yōu)異的抗病親本，同時(shí)也為抗黃萎病的機(jī)制解析提供變異豐富的遺傳材料，本研究對(duì)419份陸地棉核心種質(zhì)資源進(jìn)行了苗期黃萎病抗性鑒定。

1973—1980年，陳振聲等[6]采用田間黃萎病病圃種植的方法經(jīng)過8年的時(shí)間分批次鑒定了566份資源材料，其中抗病品種占5.83%；1983—1986年，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所采用無底紙缽定量蘸菌液法，對(duì)911份陸地棉資源進(jìn)行了鑒定，抗病資源占5.16%[28]；1986—1987年，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所對(duì)1 512份陸地棉資源在枯、黃萎病混生病圃中進(jìn)行鑒定，共鑒定出12份抗黃萎病材料，占供試材料的0.8%[7]。本研究鑒定的419份核心種質(zhì)資源蘊(yùn)藏著豐富的遺傳多樣性，病情指數(shù)分布在21.90～72.14，其中表現(xiàn)為抗、耐、感病的材料分別占2.86%、60.38%、36.75%，抗性材料比例相對(duì)偏少，但比枯、黃萎病混生病圃鑒定的比例偏高。黃萎病的發(fā)生受環(huán)境因素的影響較大，由于田間鑒定對(duì)外界環(huán)境因素的不可控性，特別是同一地點(diǎn)不同年份之間的氣候差異較大，會(huì)對(duì)鑒定結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。黃萎病及枯萎病都屬于維管束病害，發(fā)病機(jī)理與抗病機(jī)制較類似，而植株本身的抗病機(jī)能是有限的，在枯、黃萎病混合病圃中同時(shí)對(duì)兩種病害進(jìn)行鑒定，勢(shì)必會(huì)影響植株對(duì)其中一種病害的真實(shí)抗病反應(yīng)。本研究采用室內(nèi)苗期鑒定方法，在溫濕度可控的氣候室內(nèi)嚴(yán)格按照適宜黃萎病發(fā)病的條件控制，溫度上下浮動(dòng)不超0.3 ℃，濕度上下浮動(dòng)不超過5%，因此鑒定結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確。同時(shí)核心種質(zhì)的遺傳變異豐富，有很大一部分品種是早期地方農(nóng)家品種，抗病性差，導(dǎo)致抗病品種比例不是很大。

本研究所鑒定的419份陸地棉核心種質(zhì)選自全球主要棉花生產(chǎn)國(guó)的7 362份陸地棉種質(zhì)資源庫(kù)中，雖然不同地域來源及育種時(shí)期材料數(shù)量和比例不均一，但每份種質(zhì)都是根據(jù)種質(zhì)庫(kù)所記錄的資源材料的表型、地理來源和SSR數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，最終篩選得到的，具有地域及時(shí)期的代表性。通過對(duì)核心種質(zhì)中有具體時(shí)間來源的材料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)早期、中期、現(xiàn)代材料的平均病情指數(shù)分別是51.55、48.60和43.75，表明隨著近些年黃萎病菌的逐年流行，使育種家在育種過程中不再單純只注重品質(zhì)和產(chǎn)量性狀，同時(shí)也越來越重視黃萎病抗性這一性狀，棉花抗病性已得到明顯提高。將資源材料按不同地理來源進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)來自黃河流域棉區(qū)以及北部棉區(qū)的資源材料中，抗病、耐病品種所占的比例都要高于其他幾個(gè)植棉區(qū)，來自長(zhǎng)江流域棉區(qū)的材料抗性較差。所鑒定出的12份黃萎病抗性表現(xiàn)穩(wěn)定的資源材料中，有10份都來自黃河流域棉區(qū)，進(jìn)一步說明了黃河流域棉區(qū)的整體抗性要好于其它植棉區(qū)。20世紀(jì)70年代到90年代，我國(guó)有記載的多個(gè)省(市、區(qū))黃萎病發(fā)病地區(qū)，主要分布于黃河流域及以北的棉區(qū)[29]。在發(fā)病較重的地區(qū)，育種家的育種目標(biāo)就會(huì)傾向于抗病性狀的改良，棉花自身也會(huì)向著利于抵御病害的方向進(jìn)化。