喬 妙，朱朋艷，李 靜，李璐晶，李國棟，丁 驍，袁文娟*，王宣軍*

1云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 普洱茶學(xué)教育部重點實驗室；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，昆明 650201；3云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650504；4中科院昆明植物研究所，昆明 650201

溶酶的生物合成功能障礙與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[1-4]，溶酶體作為細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)降解的主要細(xì)胞器，有助于清除細(xì)胞內(nèi)受損老化的細(xì)胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)，對于維持神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)非常重要，與神經(jīng)退行性疾病緊密相關(guān)[5,6]。藜蘆是百合科藜蘆屬植物，多年生草本植物。藜蘆屬植物全世界約有40多種，我國記載有13個種1個變種，云南有4個種[7]。葛洪所著《肘后備急方》(1955年版)中記載藜蘆能治療“中風(fēng)不省人事，牙關(guān)緊咬者”；中藥大辭典亦稱中藥藜蘆用于“中風(fēng)失語、頭痛、黃疸、疥瘡、瘧疾、痢疾的治療及殺蟲、催吐等”。藜蘆功效提示與神經(jīng)性退行性疾病有關(guān)。目前為止，藜蘆中甾體生物堿被認(rèn)為是藜蘆屬植物的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，至今已分離得到200余種，按其骨架可以分為solanidine、veratramine、jervine、cevanine 4種骨架類型[8](見圖1)，多具有C-27型甾體骨架，其中solanidine、veratramine屬于膽甾烷型生物堿，A、B、C環(huán)均為六元環(huán)，D環(huán)為五元環(huán)，根據(jù)氮原子形成的不同區(qū)分，E/F為C-16位與N形成吲哚嗪環(huán)為solanidine型生物堿，veratramine型生物堿多不具有E環(huán)，F(xiàn)環(huán)為哌啶環(huán)；jervine和cevanine屬于異膽甾烷生物堿，其特征為具c-nor-homo[14(13→12)-abeo]環(huán)體系。A、B、D環(huán)為六元環(huán)，C環(huán)均為五元環(huán)，cevanine型生物堿為C-17與F環(huán)的N原子環(huán)合而成一個新的六元環(huán)E，jervine與cevine生物堿骨架差別在于C-17與氮原子之間有無價鍵相連。目前已有的研究表明jervine型生物堿具有較強的鎮(zhèn)痛活性[9]；veratramine型生物堿的活性較為廣泛，是5-HT受體拮抗劑[10]，參與AP-1的靶DNA序列的調(diào)控[11]，阻斷鈉通道的能力[12]，veratramine型生物堿還具有很強的體內(nèi)外血小板聚集抑制活性[13]，抑制動脈血栓形成，其中抗腫瘤研究較多[14,15]；cyclopamine為首個hedgehog(Hh)信號通路抑制劑[16]，抑制該通路異常激活導(dǎo)致的腫瘤生長。綜上，此類生物堿與神經(jīng)性退行性疾病研究至今未見報道。

圖1 藜蘆屬生物堿中四種骨架類型Fig.1 Four skeletons of the steroidal alkaloids from genus Veratrum

藜蘆的功效啟示將目光集中到“中風(fēng)失語”，與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，以此為契機，選擇藜蘆藥用植物來源—毛葉藜蘆為對象開展研究。我們對毛葉藜蘆根及根莖的甲醇提取物的甾體生物堿類物質(zhì)進(jìn)行研究，以期從毛葉藜蘆根及根莖中分離得到促進(jìn)溶酶體生成的化學(xué)成分，進(jìn)而闡明毛葉藜蘆中影響溶酶體功能的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，并為神經(jīng)退行性疾病提供先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

本研究所用的原材料于2018年8月采自云南香格里拉，由云南中醫(yī)藥大學(xué)李國棟副教授鑒定為毛葉藜蘆的根及根莖。標(biāo)本存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶教育部重點實驗室(20180011)。

1.1.2 實驗儀器

DLSB-5/25型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；AVANCE III 500 MHz核磁共振波譜儀；AVANCE III 600 MHz核磁共振波譜儀；Agilent 1290/6538 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用色譜儀和Agilent 1200高效液相色譜儀；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250×9.4 mm，5 μm)。

硅膠(80～100、200～300目，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(40～70 μm，Amersham Pharmacia Biotech AB，烏普薩拉，瑞典)；MCI-gel CHP20P(75～100 μm，Mitsubishi Chemical Co.,Ltd.)；Rp-C18(40～60 μm，Merck)；薄層層析用預(yù)制硅膠GF-254(青島海浪硅膠干燥劑廠)。薄層層析展開劑為石油醚—乙酸乙酯系統(tǒng)以及氯仿—甲醇系統(tǒng)。顯色劑為稀碘化鉍鉀溶液。試劑為分析純或工業(yè)純(重蒸)，本次試驗過程中所使用的化學(xué)試劑均由天津大茂化學(xué)試劑廠提供。

1.2 方法

1.2.1 提取分離

毛葉藜蘆的干燥根及根莖(20 kg)，粉碎，用甲醇回流提取4次，每次4 L，過濾，濃縮得浸膏3 kg。浸膏經(jīng)少量水分散后，稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯適量萃取3次，收集乙酸乙酯液，濃縮得毛葉藜蘆酸性部分；水液繼續(xù)用氨水調(diào)節(jié)pH值9～10，用乙酸乙酯適量萃取4次，合并乙酸乙酯溶液，濃縮得總生物堿部分(約500 g)；生物堿部分用硅膠(80～100目)拌樣，用石油醚-乙酸乙酯(1∶0→0∶1，V/V)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，TLC檢測(稀碘化鉍鉀顯色)，合并，得到5個部分Fr.A～E；Fr.C(50 g)餾分經(jīng)MCI色譜柱(甲醇—水，40∶60→90∶10)梯度洗脫，TLC檢測(稀碘化鉍鉀顯色)，得到4個餾分Fr.C1～C4和化合物1(2 g)。Fr.C1(2.8 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(i.d.2.0 cm×180 cm，40～70 μm)，甲醇洗脫得化合物2(500 mg)和Fr.C1III(200 mg)，F(xiàn)r.C1III進(jìn)一步用半制備液相色譜儀經(jīng)乙腈-0.01%三乙胺(80∶20)為流動相洗脫分離得化合物7(10 mg)；Fr.C3(5.4 g)經(jīng)硅膠柱(200～300目)，用石油醚—乙酸乙酯(25∶1)洗脫得化合物5(20 mg)和Fr.C3II(2 g)；Fr.C3II經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(i.d.2.0 cm×180 cm,40～70 μm)，繼續(xù)用半制備液相色譜儀分離得化合物3(20.1 mg)、4(3.2 mg)；Fr.D(60g)餾分經(jīng)反相RP-C18柱(甲醇—水，50∶50→80∶20)梯度洗脫，TLC檢測(稀碘化鉍鉀顯色)，得到3個餾分Fr.D1～D3，F(xiàn)r.D2(10.2 g)經(jīng)硅膠柱(200～300目)，用二氯甲烷—乙酸乙酯(4∶1)洗脫得化合物8(25.8 mg)和Fr.D2III，F(xiàn)r.D2III(820 mg)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(i.d.2.0 cm×180 cm，40～70 μm)，半制備液相色譜儀分離得化合物6(10 mg)。

1.2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

對分離得到的化合物，利用理化性質(zhì)、1D NMR(1H、13C NMR)、ESI-MS和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比等手段確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 促進(jìn)溶酶體生成活性篩選[17]

將HeLa細(xì)胞鋪于12孔板，待每孔細(xì)胞生長到80%左右時，在細(xì)胞狀態(tài)良好的情況下，將溶解于DMSO中的甾體生物堿加入到培養(yǎng)液中至終濃度為20 μM。放置培養(yǎng)箱中孵育3 h后加入Lysotracker Red DND 99，使Lysotracker Red DND 99終濃度為0.3 μM，繼續(xù)孵育30 min。孵育后，去除含有Lysotracker Red DND 99的培養(yǎng)液，添加新的培養(yǎng)液，可直接置于激光共聚焦顯微鏡下觀測并篩選熒光強度減弱或增強的處理組。DMSO處理組作為陰性對照，HEP-14處理組為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色無定形粉末；ESI-MS：m/z410 [M+H]+；分子式為C27H39NO2；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.07(1H，d，J=7.8 Hz，H-16)，6.94(1H，d，J=7.8 Hz，H-15)，5.49(1H，d，J=7.8 Hz，H-6)，2.30(3H，s，H-18)，1.35(3H，d，J=7.2 Hz，H-21)，1.15(3H，s，H-19)，0.82(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：145.1(C-14)，144.1(C-5)，144.1(C-17)，141.2(C-12)，133.7(C-13)，126.4(C-16)，122.8(C-6)，120.9(C-15)，72.6(C-3)，71.9(C-23)，67.9(C-22)，58.8(C-9)，54.6(C-26)，45.0(C-24)，42.7(C-8)，42.5(C-4)，39.3(C-1)，38.1(C-10)，32.6(C-25)，32.0(C-2)，31.6(C-11)，31.4(C-7)，21.2(C-21)，19.6(C-27)，19.2(C-19)，16.0(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道基本一致，故確定該化合物為veratramine。

化合物2白色無定形粉末；ESI-MS：m/z398 [M+H]+；分子式為C27H43NO；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.35(1H，br s，H-6)，1.01(3H，s，H-19)，0.92(3H，d，J=6.7 Hz，H-21)，0.84(3H，s，H-18)，0.84(3H，d，J=8.2 Hz，H-27)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：140.8(C-5)，121.7(C-6)，74.7(C-22)，71.8(C-3)，69.1(C-16)，63.1(C-17)，60.3(C-26)，57.6(C-14)，50.2(C-9)，42.3(C-4)，40.3(C-13)，40.0(C-12)，37.3(C-1)，36.7(C-20)，36.6(C-10)，33.4(C-15)，32.1(C-7)，31.7(C-24)，31.7(C-8)，31.3(C-2)，31.1(C-25)，29.2(C-23)，20.9(C-11)，19.5(C-18)，19.4(C-27)，18.7(C-21)，16.9(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道基本一致，故確定該化合物為solasodine。

化合物3白色無定形粉末；ESI-MS：m/z414 [M+H]+；分子式為C27H43NO2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.36(1H，br s，H-6)，1.01(3H，s，H-19)，0.95(3H，d，J=6.3 Hz，H-21)，0.89 (3H，s，H-18)，0.84(3H，d，J=6.7 Hz，H-27)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：140.6(C-5)，121.7(C-6)，74.6(C-22)，72.7(C-12)，71.7(C-3)，68.3(C-16)，60.1(C-26)，54.0(C-17)，49.1(C-9)，44.4(C-13)，43.9(C-14)，42.3(C-4)，40.0(C-12)，37.2(C-1)，36.6(C-20)，36.3(C-10)，33.3(C-11)，31.8(C-7)，31.7(C-24)，31.6(C-8)，31.0(C-2)，31.0(C-25)，29.2(C-23)，28.4(C-15)，19.5(C-18)，19.3(C-27)，18.1(C-21)，17.7(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報道基本一致，故確定該化合物為epirubijervine。

化合物4白色無定形粉末；ESI-MS：m/z426 [M+H]+；分子式為C27H39NO3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.31(1H，br s，H-6)，3.69(1H，m，H-3)，3.40(1H，m，H-23)，2.12(3H，s，H-19)，1.09(3H，d，J=7.5 Hz，H-27)，1.01(3H，d，J=6.7 Hz，H-21)，0.93(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：207.0(C-11)，143.2(C-13)，142.1(C-11)，138.3(C-12)，120.8(C-6)，86.4(C-17)，72.5(C-23)，71.1(C-3)，63.6(C-22)，62.5(C-9)，55.1(C-26)，44.5(C-14)，41.0(C-4)，38.2(C-20)，37.9(C-8)，37.1(C-10)，37.0(C-24)，36.7(C-1)，30.6(C-16)，30.5(C-7)，30.3(C-2)，24.1(C-15)，18.3(C-27)，17.9(C-18)，12.1(C-19)，11.0(C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報道基本一致，故確定該化合物為jervine。

化合物5白色無定形粉末；ESI-MS：m/z636 [M+H]+；分子式為C34H54NO3；1H NMR(500 MHz，CDCl3,)δ：5.35(1H，d，J=3.3 Hz，H-15)，4.91(1H，d，J=4.2 Hz，H-3)，4.60(1H，s，H-7)，2.07(1H，s，H-2′′)，2.04(1H，s，H-2′)，1.18(3H，s，H-21)，1.13(3H，d，J=7.0 Hz，H-5′)，1.07(3H，d，J=7.1 Hz，H-27)，0.96 (3H，s，H-19)，0.89(3H，d，J=7.5 Hz，H-4′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：175.7(C-1′)，170.5(C-1′′)，105.4(C-4)，92.9(C-9)，81.2(C-14)，74.6(C-3)，73.0(C-20)，69.7(C-15)，69.6(C-22)，69.3(C-22)，66.7(C-7)，61.4(C-26)，61.3(C-18)，47.9(C-8)，47.4(C-17)，46.0(C-5)，45.9(C-10)，45.5(C-12)，41.2(C-2′)，33.8(C-13)，33.1(C-11)，32.3(C-1)，28.9(C-24)，28.5(C-6)，27.3(C-25)，26.8(C-2)，26.4(C-3′)，21.5(C-21)，19.8(C-1′′)，19.1(C-19)，18.4(C-23)，17.1(C-27)，16.8(C-5′)，11.6(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報道基本一致，故確定該化合物為3-acetyl-15-methylbutyroylgermine。

化合物6白色無定形粉末；ESI-MS：m/z414 [M+H]+；分子式為C27H43NO2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.33(1H，brs，H-6)，1.04(3H，s，H-19)，1.01(3H，d，J=6.7 Hz，H-21)，0.84(3H，d，J=6.4 Hz，H-27)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：140.9(C-5)，121.7(C-6)，73.6(C-22)，71.8(C-3)，69.1(C-16)，63.0(C-19)，60.3(C-17)，57.9(C-26)，57.4(C-14)，50.2(C-9)，45.6(C-13)，42.3(C-4)，40.0(C-12)，37.3(C-1)，36.7(C-10)，36.1(C-20)，33.4(C-2)，32.1(C-7)，31.8(C-24)，31.6(C-25)，30.9(C-8)，30.6(C-23)，29.6(C-15)，21.0(C-11)，19.5(C-19)，19.5(C-27)，19.4(C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報道基本一致，故確定該化合物為isorubijervine。

化合物7白色無定形粉末；ESI-MS：m/z414 [M+H]+；分子式為C27H43NO2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.37(1H，m，H-15)，3.41(1H，m，H-3)，3.20(3H，m，OCH3)，2.99(1H，d，J=6.3 Hz，H-22)，1.77(3H，s，H-19)，0.97(3H，s，H-18)，0.87(3H，d，J=6.7 Hz，H-27)，0.85(3H，d，J=7.7 Hz，H-21)；13C NMR(125 MHz，CDCl3,)δ：144.1(C-13)，127.4(C-12)，122.6(C-6)，106.4(C-23)，90.2(C-17)，72.5(C-3)，65.3(C-22)，53.9(C-9)，49.8(C-14)，48.7(C-20)，47.6(OCH3)，43.9(C-8)，43.2(C-7)，42.6(C-4),40.0(C-24)，39.4(C-1)，37.9(C-10)，32.0(C-2)，30.4(C-25)，30.4(C-25)，29.0(C-11)，29.0(C-16)，25.3(C-15)，19.3(C-27)，18.8(C-18)，15.5(C-19)，12.2(C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報道基本一致，故確定該化合物為23-methoxy-cyclopamine。

化合物 8白色無定形粉末；ESI-MS：m/z：412 [M+H]+；分子式為C27H41NO2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.39(1H，brs，H-6)，1.28(3H，s，H-19)，1.17(3H，s，H-18)，1.01(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.87(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：142.2(C-5)，122.2(C-6)，75.9(C-22)，72.1(C-3)，69.3(C-16)，61.4(C-26)，58.6(C-17)，56.1(C-13)，54.9(C-9)，54.1(C-14)，42.8(C-4)，38.5(C-20)，38.4(C-12)，38.1(C-1)，34.1(C-10)，32.6(C-11)，32.2(C-7)，32.1(C-24)，32.0(C-8)，31.0(C-2)， 31.0(C-25)，29.8(C-23)，28.7(C-15)，19.8(C-18)，19.3(C-27)，16.9(C-21)，16.7(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報道基本一致，故確定該化合物為rubijervone-12。

2.2 促進(jìn)溶酶體生成活性測定結(jié)果

利用中科院昆明植物研究所郝小江課題組構(gòu)建的促進(jìn)溶酶體生成活性的細(xì)胞篩選平臺，對已分離得到的藜蘆屬生物堿類化合物進(jìn)行了篩選，化合物1、2、3、6和7均能促進(jìn)溶酶體生成，其中化合物6效果最佳(如圖2)；化合物6處理3 h，呈現(xiàn)出更多的Lysotracker 標(biāo)記的溶酶體，大幅度的增加細(xì)胞中溶酶體的數(shù)量。HEP-14為PKC激動劑，為陽性對照。

圖2 化合物1、2、3、6和7顯著促進(jìn)溶酶體生成Fig.2 Compounds 1,2,3,6 and 7 significantly promoted lysosomal biosynthesis 注：M：空白；Hep-14：陽性對照；A：化合物2；B：化合物7；C：化合物3；D：化合物6；E：化合物1；1：20 μM；2：40 μM。Note: M: Blank;Hep-14: Positive control;A: Compound 2;B: Compound 7; C: Compound 3;D: Compound 6;E: Compound 1;1: 20 μM; 2: 40 μM.

3 討論

意大利學(xué)者Ballabio課題組研究發(fā)現(xiàn)溶酶體的生成在轉(zhuǎn)錄水平上主要是由MiTF/TFE家族的轉(zhuǎn)錄因子TFEB和TFE3所調(diào)控的，在多種組織中均有表達(dá)[25]。在細(xì)胞正常的狀態(tài)下，TFEB是磷酸化的，與14-3-3蛋白結(jié)合而彌散于細(xì)胞質(zhì)中。但是在外界刺激下，例如饑餓或者溶酶體功能受損時，或細(xì)胞受到脅迫后，TFEB去磷酸化從而進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控下游基因的表達(dá)，廣泛參與各種生理病理活動[26]。TFEB的磷酸化也受到體內(nèi)外各種蛋白分子的調(diào)節(jié)。通過TFEB/CLEAR網(wǎng)絡(luò)作為調(diào)控中心，促進(jìn)溶酶體的生成和相關(guān)的溶酶體降解功能(大分子降解，自噬-溶酶體通路，有絲分裂和噬脂等)，在改善神經(jīng)退行性疾病中有著至關(guān)重要的作用。目前，文獻(xiàn)報道調(diào)控TFEB入核的小分子化合物，有巨大戟烷型二萜HEP14和HEP15、重樓皂苷XVII、姜黃素衍生物[27,28]；未見甾體生物堿促進(jìn)溶酶體生成的報道。故尋找新結(jié)構(gòu)類型促進(jìn)溶酶體生物發(fā)生的先導(dǎo)化合物，并探討其作用機制，為新治療神經(jīng)退行性藥物開發(fā)提供新的思路。

本研究從中醫(yī)藥理論指導(dǎo)思想出發(fā)，目光聚焦于藜蘆治療“中風(fēng)失語”，推測與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，以此為契機開展毛葉藜蘆化學(xué)成分的研究，深入挖掘藜蘆的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，探討是否能夠促進(jìn)溶酶體的生成，為神經(jīng)性退行疾病的治療提供先導(dǎo)化合物。本次實驗從毛葉藜蘆中分離得到了8個甾體生物堿類成分，化合物1、2、3、6和7均能促進(jìn)溶酶體生成，其中化合物6效果最佳，我們發(fā)現(xiàn)化合物6能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子TFEB入核，后續(xù)將對篩選得到的化合物進(jìn)行溶酶體功能的驗證以及作用機制的研究。