柏友蘭，劉明偉，王小杰，李 欣

（承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

胃癌被認(rèn)為是目前全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，特別是在中國和其他亞洲國家，死亡率均居于惡性腫瘤平均死亡率的第2位[1]。其早期癥狀缺少特異性，多數(shù)病例在確診過程中已被認(rèn)定為中晚期，且致死率高，5年內(nèi)生存能力差，嚴(yán)重威脅了人類的生命健康。所以，了解它們的發(fā)病機理、尋找合適的診斷和預(yù)后指示標(biāo)志物意義重大。膜聯(lián)蛋白（annexin）是鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、癌癥進展和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。膜聯(lián)蛋白A7（annexin A7，ANXA7）又稱synexin，屬于A組Annexin家族。研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)胃腸道癌癥中，ANXA7異常表達，是一種特異性的促癌候選基因[3]。然而，其對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響目前尚不清楚。因此，本研究通過在胃癌MGC-803細(xì)胞中敲低ANXA7，觀察其可否引起細(xì)胞遷移和侵襲的改變，從而探討膜聯(lián)蛋白A7在胃癌轉(zhuǎn)移過程中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器設(shè)備

細(xì)胞1640培養(yǎng)液及胎牛血清FBS（Gibco公司，美國）；靶向ANXA7及陰性siRNA（吉瑪基因，蘇州）；lipo2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國）；GAPDH、ANXA7、E-cadherin和MMP-9兔抗人單克隆一抗（Epitomics公司，美國） ；山羊抗兔二抗（KPL公司，美國）；Transwell小室（康寧公司，美國）；二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白定量試劑盒（索萊寶生物科技，北京） ；CO2培養(yǎng)箱（HER Aceu150，賀利公司，德國）；MK3酶聯(lián)蛋白檢測儀（Thermo公司，美國）；ECL發(fā)光儀（Tanon6100，上海天能公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

于上海賽百慷生物公司購入人胃癌細(xì)胞系MGC-803，使用的1640細(xì)胞培養(yǎng)液含10% FBS，置于5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于6孔板中，次日用于轉(zhuǎn)染，約（3~5）×104個/孔，分為si-ANXA7組、陰性對照組（si-con）和空白對照組（blank）；24h后細(xì)胞均勻鋪滿皿底面積的40%~70%。將30pmol/L的siRNA Ologo與250μl無血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液輕柔混勻，靜置5min；再將5μl轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000與250μl無血清1640培養(yǎng)基輕柔混勻，亦靜置5min。Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑分別與靶向ANXA7的siRNA和陰性對照siRNA混合均勻，靜置20min后，分別將混合液準(zhǔn)確加至干擾組及陰性對照組培養(yǎng)孔中，空白對照組則加2ml常規(guī)培養(yǎng)基，放入二氧化碳箱中。6h后換液，更換為含10%血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 Western blotting檢測siRNA轉(zhuǎn)染后MGC-803細(xì)胞ANXA7抑制效率

轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，每孔加入120μl RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法測出濃度后，將蛋白與5×Loading Buffer混合，置于100℃煮沸變性10min。制作12% SDS-PAGE凝膠，每樣品孔等質(zhì)量加入30μg蛋白，80~120V蛋白電泳2h。電泳后濕轉(zhuǎn)法（200mA，1.5h）將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，再將膜放入5% 脫脂奶粉溶液中封閉2h，GAPDH（1:1000），ANXA7（1:1000）單克隆抗體于4℃孵育一夜；次日用TBST洗3次，時間分別為15min、10min、5min，以洗掉非特異性結(jié)合的一抗；山羊抗鼠二抗（1:5000）室溫孵育1.5h，TBST再洗3次，每次6min；最后放入ECL化學(xué)發(fā)光儀顯影。用Quantity One軟件分析圖像，計算ANXA7/GAPDH數(shù)值，ANXA7蛋白的相對表達量即被測出。

1.4 細(xì)胞劃痕實驗檢測各組MGC-803細(xì)胞遷移能力的變化

六孔板中細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中生長成90%密度的融合單層。用200μl槍頭沿著直尺，垂直于培養(yǎng)板底部均勻地劃出一條直線；吸去舊培養(yǎng)基，并用PBS緩沖液沖洗3次以清除劃下的細(xì)胞碎片；再在每孔中加入新鮮的無血清RPMI1640培養(yǎng)基，放回恒溫孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)；分別于0、12、24、36、72h用光學(xué)顯微鏡觀察并測量初始劃痕間隙寬度（0h）和剩余劃痕間隙寬度。

1.5 Transwell實驗檢測各組MGC-803細(xì)胞侵襲能力的變化

siRNA轉(zhuǎn)染后48h，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打混勻后，取100μl單細(xì)胞懸液置入Transwell小室的上部；再在Transwell下室中置入600μl含20%胎牛血清（FBS）的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液作為化學(xué)誘導(dǎo)劑，以血清濃度差作為趨化條件；移入5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h。之后取出小室，吸棄室內(nèi)培養(yǎng)基，甲醇固定細(xì)胞5min，棄固定液，再用Giemsa染液染色3min；自來水慢慢洗去染色液，用棉簽擦除小室上表面的細(xì)胞，快速干燥后，將聚碳酸醋膜切下貼于載玻片上，滴加中性樹膠，再蓋上蓋玻片封片。于顯微鏡下觀察并攝片（100倍），隨機選取5個視野計數(shù)細(xì)胞，并計算出觀察到的5個視野中的平均細(xì)胞數(shù)。

1.6 Western blotting檢測E-cadherin、MMP-9蛋白的表達

收集細(xì)胞，每孔加入120μl RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法測出濃度后，將蛋白與樣品處理液均勻混合，置于100℃煮沸變性10min。制作12% SDS-PAGE凝膠，每樣品孔30μg等質(zhì)量上樣，80~120V電泳2h。電泳后濕轉(zhuǎn)法（200mA，1.5h）將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，再置入5%脫脂奶粉溶液中封閉2h，GAPDH（1:1000），E-cadherin、MMP-9兔抗人單克隆一抗（1∶2000）于4℃孵育一夜；次日取出用TBST洗3次，時間分別為15min、10min、5min以洗掉非特異性結(jié)合的一抗；山羊抗兔二抗（1:5000）室溫孵育1.5h后，TBST再洗3次，每次洗6min；最后放入ECL化學(xué)發(fā)光儀顯影。用Quantity One軟件分析圖像，分別計算E-cadherin、MMP-9條帶與GAPDH條帶的灰度值比，即為E-cadherin、MMP-9蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，組間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶向ANXA7的siRNA抑制效率鑒定

Western blotting檢測結(jié)果顯示（圖1），干擾組ANXA7的表達顯著低于陰性組和空白對照組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。陰性組和空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 Western blot檢測ANXA7蛋白的表達

2.2 ANXA7下調(diào)后各組細(xì)胞遷移情況

MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h行細(xì)胞劃痕，分別于0h、12h、24h、36h、72h攝片記錄劃痕愈合情況。結(jié)果顯示（圖2），與陰性組和空白對照組相比，siRNA干擾組細(xì)胞遷移能力明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陰性組和空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組細(xì)胞劃痕愈合情況

2.3 ANXA7下調(diào)后各組細(xì)胞侵襲情況

Transwell結(jié)果顯示（圖3），與陰性組和空白對照組相比，siRNA干擾組細(xì)胞侵襲能力明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陰性組和空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組細(xì)胞Transwell侵襲實驗結(jié)果

2.4 各組細(xì)胞E-cadherin及MMP-9的表達

siRNA干擾組E-cadherin蛋白表達顯著高于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；siRNA干擾組MMP-9蛋白表達顯著低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陰性對照組和空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 Western blot檢測E-cadherin及MMP-9蛋白的表達

3 討論

胃癌作為第二大高死亡率的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居世界第四。盡管近年來手術(shù)技術(shù)和抗癌藥物有所完善，但胃癌患者的五年生存率仍處于較低水平[4]。手術(shù)切除是胃癌最常見的治療策略，基因組測序和精準(zhǔn)治療的進展則開創(chuàng)了新的癌癥治療方法，但無論是靶向治療還是新的輔助化療都沒有能明顯改善晚期胃癌患者的預(yù)后[5,6]。因此，開發(fā)新的胃癌早期診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物是目前當(dāng)務(wù)之急。

ANXA7是脊椎動物細(xì)胞膜聯(lián)蛋白家族的重要成員，含有一個超長的氨基末端，在胞吐過程的膜融合中起重要作用[7]。其主要在細(xì)胞質(zhì)中表達，分布廣泛于心臟、腦和骨骼肌。它在細(xì)胞骨架活性、膜磷脂化、膜受體調(diào)節(jié)以及有絲分裂中發(fā)揮重要功能[8]。據(jù)報道，ANXA7在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[9]。有學(xué)者在既往研究中了解到，ANXA7蛋白表達水平與腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，還發(fā)現(xiàn)miR-124-3p通過下調(diào)ANXA7基因降低Bcl-2、MMP-9等的表達，從而抑制肝癌細(xì)胞的生長、侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并證實ANXA7促進了肝細(xì)胞癌的進展和轉(zhuǎn)移[10]。Hu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ANXA7在低分化的胃癌細(xì)胞系和高度侵襲性的人胃癌組織中都有高表達，認(rèn)為ANXA7的高表達是胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良的潛在指標(biāo)，但ANXA7對胃癌細(xì)胞的具體作用機制尚不清楚。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在胃癌患者中，胃癌的分化程度與ANXA7的表達水平呈負(fù)相關(guān)，因此認(rèn)為ANXA7可能是預(yù)測胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在因子，提示ANXA7的表達可能是腫瘤侵襲的候選生物標(biāo)志物[12]。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們認(rèn)為ANXA7的高表達增強了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系較為緊密的基質(zhì)金屬蛋白酶分別為基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9，二者能起到降解基底膜上IV型膠原的作用。先前的研究結(jié)果表明，MMP-9的表達與胃癌發(fā)展和淋巴轉(zhuǎn)移有著緊密聯(lián)系[13]。我們的研究表明，ANXA7的低表達顯著下調(diào)了MGC-803細(xì)胞的侵襲能力及MMP-9的表達，提示下調(diào)MMP-9活性可能是ANXA7抑制MGC-803細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制之一。

鈣粘附素是一種跨膜糖蛋白，能起到維持上皮結(jié)構(gòu)及細(xì)胞極性等作用[14]。E-cadherin叫做E-鈣粘蛋白（E-cad），作為上皮細(xì)胞間的粘附連接最關(guān)鍵、最普遍的成分之一，在功能上與極化上皮表型的產(chǎn)生有關(guān)。大量研究表明，E-cad的下調(diào)、突變或功能喪失可能與多種癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移表型有關(guān)。在過去的幾十年中，E-cad的抑瘤功能已經(jīng)出現(xiàn)在包括胃癌在內(nèi)的不同種上皮型腫瘤中，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中觀察到它的下調(diào)，此現(xiàn)象還關(guān)系到腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。有研究將E-cad定義為腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移抑制基因，其表達增多會抑制不同種類癌癥的浸潤與轉(zhuǎn)移[15]，而其表達的逐漸減少與體內(nèi)癌細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移和去分化有關(guān)。我們的研究表明，在MGC-803細(xì)胞中抑制ANXA7表達后，E-cadherin的表達上升，并抑制細(xì)胞的遷移。提示ANXA7低表達通過上調(diào)E-cadherin的表達抑制MGC-803細(xì)胞的遷移能力。

綜上所述，敲低ANXA7可能通過上調(diào)E-cadherin并下調(diào)MMP-9的表達來抑制MGC-803細(xì)胞的遷移性和侵襲性，但具體通過哪條通路發(fā)揮作用還需進一步的研究來揭示。作為促進胃癌發(fā)生發(fā)展的癌基因，使用ANXA7 siRNA的方法可能為胃癌患者帶來新的治療選擇。