黃金耒，錢孟波 ，賈 楠 ，郎沖沖 ，王海峰 ，朱 君 ，李 斌 ，王 偉

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)光機(jī)電工程學(xué)院，浙江 杭州 311314；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院智能裝備技術(shù)研究中心，北京 100097； 3.國家農(nóng)業(yè)智能裝備工程技術(shù)研究中心，北京 100097；4.棗莊市市中汽車性能檢測站，山東 棗莊 277100）

0 引言

飼料作為動物性食品的重要物質(zhì)保障，是養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，飼料產(chǎn)品營養(yǎng)均衡是畜禽健康生長和農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的前提，做好飼料營養(yǎng)成分分析檢測，是生產(chǎn)飼料的必要環(huán)節(jié)，可以保證飼料原料和飼料產(chǎn)品的品質(zhì)。目前，檢測飼料中營養(yǎng)成分的方法主要有傳統(tǒng)方法和光譜分析技術(shù)。傳統(tǒng)方法已經(jīng)是成熟的技術(shù)，并且已經(jīng)在多個領(lǐng)域得到應(yīng)用，甚至凱氏定氮法等已經(jīng)成為國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，但它們?nèi)匀挥性S多局限性。例如：檢測時間長、線性范圍窄、樣品制備方法復(fù)雜，還有測試結(jié)果取決于檢查員的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)知識等。所以，尋找一種快速、準(zhǔn)確、操作簡便的新型方法來檢測營養(yǎng)物質(zhì)尤為重要?；谏鲜鲈?，光譜分析用于檢測飼料營養(yǎng)成分的方法迅速發(fā)展起來。光譜技術(shù)包括拉曼光譜及表面增強(qiáng)拉曼、近紅外反射及傅里葉變換近紅外、高光譜和太赫茲時域光譜等，可以通過單次掃描提供與營養(yǎng)成分及其結(jié)構(gòu)相關(guān)的定性定量信息。此外，這些技術(shù)很少需要樣品制備和預(yù)處理。因此，它們是快速測定飼料營養(yǎng)成分的理想方法。

飼料產(chǎn)品的常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)通常是指粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪、粗灰分、礦物質(zhì)、水分等[1]。主要營養(yǎng)成分可概括為6類：蛋白質(zhì)是由氨基酸所形成的線性聚合物，飼料中蛋白質(zhì)平均氮量為16%；碳水化合物分子通式是（CH2O）n，為飼養(yǎng)動物體供能；脂肪需要吸收氧來氧化脂肪的碳和氫，產(chǎn)熱量高；維生素是調(diào)節(jié)動物生長、生產(chǎn)、繁殖和保證動物健康所必需的有機(jī)物質(zhì)；礦物質(zhì)飼料包括提供碳、氫、氧、氮、硫、鈣、磷等常量元素的飼料以及提供鐵、鋅、銅、碘等微衡量元素的無機(jī)鹽類等；水分對動物起著至關(guān)重要的作用，動物采食水比干物質(zhì)多，而且動物缺水時會死亡更快。飼料主要營養(yǎng)成分分類及生理作用如表1所示。

表1 飼料中主要營養(yǎng)成分分類及生理作用

目前，國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者積極開展飼料中營養(yǎng)成分檢測方法研究，這對畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。基于此，課題組首先分析了飼料中主要營養(yǎng)成分及其生理作用；然后對飼料營養(yǎng)成分的傳統(tǒng)檢測技術(shù)展開介紹，通過分析得出，飼料中營養(yǎng)成分傳統(tǒng)檢測方法存在適用性差和消耗材料多等缺點(diǎn)；最后重點(diǎn)探討了光譜技術(shù)應(yīng)用在飼料營養(yǎng)成分檢測方面的研究進(jìn)展，進(jìn)而得出光譜檢測技術(shù)存在著快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，在營養(yǎng)檢測方面展現(xiàn)出了巨大的潛力。

1 傳統(tǒng)檢測方法

飼料中營養(yǎng)成分檢測就是要對其性質(zhì)和含量進(jìn)行分析，在檢測分析的層面，不僅要確保精確度和靈敏度足夠高，還要節(jié)省時間，避免浪費(fèi)大量的檢測材料，簡化檢測步驟。目前，我國國家標(biāo)準(zhǔn)已有規(guī)范的檢測方法，包括對飼料中粗蛋白[5]、水分[6]、鈣[7]、粗脂肪[8]、維生素B2[9]等的測定。部分國家標(biāo)準(zhǔn)測定法的簡要原理、檢出限和定量限如表2所示。

除了上述表格的內(nèi)容，檢測范圍還包括粗纖維[10]、粗灰分[11]、總磷[12]、維生素E[13]、維生素D3[14]、維生素B1[15]、維生素B6[16]、維生素B12[17]、維生素A[18]、維生素K3[19]，以及飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉、鋅含量的測定[20]。由表2可知，國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法比較完善，但都有各自優(yōu)缺點(diǎn)，比如凱氏定氮法操作簡便，但適用性低；熒光分光光度法靈敏度高，但操作復(fù)雜且消耗試劑多；高效液相色譜法檢出率高，但儀器昂貴且耗時長。所以，發(fā)展能快速測定、簡化處理步驟、節(jié)省檢測材料等的定性定量分析方法具有重要意義。

表2 國家標(biāo)準(zhǔn)測定法

目前，檢測飼料中蛋白質(zhì)含量應(yīng)用較多的還有雙縮脲法，優(yōu)點(diǎn)是快速、干擾物質(zhì)少，但靈敏度差。雙縮脲法[21]檢測蛋白質(zhì)是利用氨基酸的氨基與羧基相互作用生成-CONH-基團(tuán)，這種基團(tuán)在堿性環(huán)境中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成物質(zhì)的顯色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。用雙縮脲法檢測飼料中的蛋白質(zhì)，是把飼料樣品與堿性溶液混合，再經(jīng)過雙縮脲試劑處理，反應(yīng)后所得吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出所對應(yīng)的值，得到飼料樣品蛋白質(zhì)含量。Liu等[22]通過引入一種堿性試劑與十二烷基硫酸鈉的結(jié)合和熱處理，建立了一種適用于玉米基產(chǎn)品蛋白質(zhì)測定的改良雙縮脲法，該方法提高了以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測玉米醇溶蛋白含量的準(zhǔn)確性。

與國標(biāo)方法相比，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS）增加了飼料中維生素檢測的靈敏度，能夠?qū)Φ蜐舛葮悠愤M(jìn)行檢測，但使用的儀器昂貴，檢測成本高。LC-MS是通過液相色譜分離后的各個組分依次進(jìn)入質(zhì)譜檢測器，各組分在離子源被離子化，產(chǎn)生帶有一定電荷、質(zhì)量數(shù)不同的離子。不同離子在電磁場中的運(yùn)動行為不同，采用質(zhì)量分析器按不同質(zhì)荷比（m/z）把離子分開，得到依質(zhì)荷比順序排列的質(zhì)譜圖。通過對質(zhì)譜圖的分析處理，可以得到樣品的定性和定量結(jié)果。梁玉樹等[23]建立了超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），可同時測定配合飼料中6種水溶性維生素（VB1、VB2、VB3、VB6、VB7、VB12）的方法。結(jié)果表明，上述6種維生素的檢出限為0.05 μg/kg～1.97 μg/kg，定量限為0.16 μg/kg～6.5 μg/kg。王博等[24]使用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測定豬濃縮飼料中25-羥基維生素D3的含量，結(jié)果顯示，該方法的檢測限和定量限分別為5 μg·kg-1、10 μg·kg-1。

2 基于光譜技術(shù)的飼料營養(yǎng)成分檢測研究進(jìn)展

為了評估原材料、產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，定量分析營養(yǎng)成分是必不可少的。近年來，快速發(fā)展的光譜技術(shù)也逐漸應(yīng)用于飼料原料及其產(chǎn)品營養(yǎng)成分的定量分析。國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者積極展開研究，取得了不錯的成果。

2.1 光譜技術(shù)及其特點(diǎn)

光譜方法中拉曼光譜[25]可以得到樣品分子振動或轉(zhuǎn)動信息，從而可用于物質(zhì)鑒定。而表面增強(qiáng)拉曼光譜的發(fā)展很大程度上提高了拉曼技術(shù)的靈敏度，它在檢測速度和低樣品消耗以及生物友好的環(huán)境和水檢測條件方面也顯示出優(yōu)勢。近紅外光譜[26]通過分子振動激發(fā)從樣品中提取信息，根據(jù)透射輻射與入射輻射的比率獲得光譜信息，利用有機(jī)物在近紅外光譜區(qū)的振動吸收，從而快速測定樣品中各種化學(xué)成分的含量。傅里葉變換近紅外[27]是通過在近紅外區(qū)域（4 000 cm-1～12 000 cm-1）使用傅里葉變換技術(shù)，與色散儀器相比，提高了光譜再現(xiàn)性和波數(shù)精度。傅里葉變換近紅外廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，例如：制藥[28]、石油[29]、食品[30]。傅里葉變換近紅外光譜的優(yōu)點(diǎn)是快速、準(zhǔn)確和無損，因此，這是一種很有前景的檢測技術(shù)。但實(shí)際上，在一些重要的情況下，需要質(zhì)量參數(shù)的空間分布[31]，而僅使用基于圖像處理的計算機(jī)視覺技術(shù)無法提供所需的光譜信息。因此，高光譜成像被引入，它同時包含了物質(zhì)的光譜信息和二維空間信息[32]，它將成像和光譜學(xué)集成在一個系統(tǒng)中，提供來自物體的光譜和空間信息，這些信息形成了一個三維數(shù)據(jù)，比單方面成像或光譜信息更詳細(xì)地表征物體[33]。然而，這些方法不能探測遠(yuǎn)紅外線光譜區(qū)，該光譜區(qū)包含研究材料的大量物理和化學(xué)信息。而太赫茲輻射（0.1 THz～10 THz頻率范圍內(nèi)的輻射）位于遠(yuǎn)紅外范圍內(nèi)[34]。太赫茲時域光譜技術(shù)是通過太赫茲脈沖在樣品上透射或反射，直接獲取樣品的時域波形，然后通過傅里葉變換得到其相應(yīng)的頻域分布波形，通過分析和計算該頻譜的光譜數(shù)據(jù)，就可以得到被測樣品的折射率、吸收系數(shù)等，后續(xù)結(jié)合化學(xué)計量法建模可以對物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。太赫茲光譜作為光電技術(shù)的一種，由于其具有低能量、寬頻帶、高靈敏度、高分辨率和穿透性等特點(diǎn)而被認(rèn)為是最有前景的檢測方法之一。而且太赫茲光譜對檢測物質(zhì)中目標(biāo)分子的微小差異和變化極其敏感[35]，包括分子間和分子內(nèi)的相互作用，因此太赫茲光譜被用于研究化學(xué)材料的結(jié)構(gòu)和相互作用。近年來，太赫茲光譜廣泛應(yīng)用于安全檢查[36]、材料科學(xué)[37]、軍事通信[38]、生物醫(yī)學(xué)[39]和農(nóng)業(yè)產(chǎn)品檢驗(yàn)[40]等領(lǐng)域，也有學(xué)者開始探索太赫茲時域光譜技術(shù)檢測飼料谷物中的營養(yǎng)物質(zhì)。

2.2 蛋白質(zhì)成分檢測研究進(jìn)展

飼料中蛋白質(zhì)對畜禽的生命活動起著關(guān)鍵性的作用，其生理作用是其他營養(yǎng)成分不可代替的。但某些飼料、食品生產(chǎn)企業(yè)為了利益最大化，向產(chǎn)品中添加非蛋白含氮物質(zhì)冒充高蛋白產(chǎn)品，這種低蛋白飼料不僅會影響動物正常發(fā)育，還會危害畜禽健康，進(jìn)而嚴(yán)重影響人類食品衛(wèi)生安全。所以，對飼料中粗蛋白定量定性分析是飼料品質(zhì)劃分的重要環(huán)節(jié)。Bao等[41]選擇利用拉曼光譜儀檢測蛋白，通過使用鋁和碘離子修飾的銀納米粒子，所研究的蛋白質(zhì)檢測靈敏度顯著提高。王勇生等[42]采集高粱的近紅外漫反射光譜，利用化學(xué)計量法建立近紅外光譜預(yù)測模型并驗(yàn)證，結(jié)果顯示，粗蛋白質(zhì)的預(yù)測模型定標(biāo)相對分析誤差、交互驗(yàn)證相對分析誤差、外部驗(yàn)證相對分析誤差分別為8.41、4.97、3.32，其建立的高粱中粗蛋白質(zhì)近紅外光譜預(yù)測模型能夠準(zhǔn)確評估高粱中粗蛋白質(zhì)含量。高睿等[43]采集牧草葉片樣本的高光譜圖像光譜信息，與所測的化學(xué)值結(jié)合建立牧草粗蛋白分析模型。結(jié)果顯示，牧草粗蛋白最優(yōu)模型決定系數(shù)、均方根誤差、相對分析誤差分別為0.933、6.034 mg/g、4.322，模型精度較高，為檢測牧草粗蛋白提供了新的思路。在太赫茲方面，岳偉偉等[44]采集三種芳香族氨基酸的太赫茲信號，結(jié)果顯示，酪氨酸和色氨酸分別在0.976 THz和1.465 THz處有明顯吸收峰。所得結(jié)果為研究蛋白質(zhì)等其他生物大分子提供方法和思路。Wei等[45]研究了太赫茲光譜和化學(xué)計量學(xué)用于大豆蛋白質(zhì)含量定量檢測的可行性。預(yù)測集相關(guān)系數(shù)、預(yù)測集均方根誤差和相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.965 9、1.308 5%和3.533 4%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，太赫茲光譜和化學(xué)計量學(xué)可以用于快速準(zhǔn)確檢測大豆中的蛋白質(zhì)含量。

2.3 維生素成分檢測研究進(jìn)展

維生素是維持畜禽生長發(fā)育的必需營養(yǎng)成分，主要是起到催化作用。每一種維生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，產(chǎn)生的生理作用有所差異，合理添加維生素能更好地促進(jìn)畜禽體內(nèi)的營養(yǎng)素合成。因此，對維生素定性定量檢測尤為重要。王萍[46]將高效薄層色譜與熒光光密度掃描以及表面增強(qiáng)拉曼光譜相結(jié)合，建立了一種定性定量分析飼料中VB2和VB9的方法。王燕妮等[47]采集3種不同載體（二氧化硅、脫脂米糠和石粉）預(yù)混合飼料的近紅外光譜進(jìn)行建模分析，結(jié)果顯示，以二氧化硅和脫脂米糠為載體的預(yù)混合飼料維生素E定量模型的預(yù)測決定系數(shù)R2分別為0.989、0.980，相對分析誤差RPD分別為8.10、6.90，說明檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用來定量分析。另外，還有將近紅外光譜檢測技術(shù)成功應(yīng)用于預(yù)混合飼料中維生素A、D3、K3和E的分析[48-51]。王芳等[52]采用透射式太赫茲時域光譜儀掃描5種維生素樣本，通過分析計算得到吸收系數(shù)，結(jié)果顯示，維生素A在1.100 THz、1.165 THz、1.405 THz處有3個吸收峰，維生素B2在1.030 THz、1.100 THz、1.165 THz處有3個吸收峰。Yu等[53]對維生素C、B1、B2和B64種維生素的太赫茲振動光譜進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)測量和理論分析。應(yīng)用全幾何優(yōu)化和使用密度泛函理論[54]的頻率計算來獲得這些維生素的結(jié)構(gòu)和振動頻率，計算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致，模擬結(jié)果表明，分子間的相互作用相當(dāng)弱，因此氣相模擬譜接近固相。計算結(jié)果證實(shí)大部分吸收峰來自分子內(nèi)模式；其他的被歸因于分子間相互作用或聲子模式。所以，結(jié)合太赫茲時域光譜和密度泛函理論計算識別維生素分子的特征光譜是可信的，太赫茲時域光譜技術(shù)將成為一種快速有效的物質(zhì)鑒別技術(shù)。

2.4 多營養(yǎng)成分檢測研究進(jìn)展

飼料中一般含有粗蛋白、粗纖維、維生素等多種營養(yǎng)成分，但是受到采集方式、生產(chǎn)工藝、儲存條件等影響，飼料營養(yǎng)品質(zhì)參差不齊，會對畜禽生長發(fā)育造成影響。因此，有必要對飼料整體營養(yǎng)成分進(jìn)行檢測分析，劃分營養(yǎng)品質(zhì)。劉哲等[55]采集牧草樣品的近紅外光譜，使用修正偏最小二乘進(jìn)行建模，結(jié)果顯示，鈣、中性洗滌纖維、干物質(zhì)、粗蛋白、粗灰分的相對分析誤差均大于3，相關(guān)系數(shù)均在0.9以上，說明這5種營養(yǎng)成分的定標(biāo)效果良好，有著較高的準(zhǔn)確度。張順等[56]用近紅外儀器掃描采集玉米DDGS樣品光譜數(shù)據(jù)。結(jié)合偏最小二乘法建立營養(yǎng)成分定量分析模型，結(jié)果顯示，水分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪定標(biāo)方程決定系數(shù)分別為0.91、0.92、0.95，相對分析誤差RPD均大于3，結(jié)果表明，傅立葉變換近紅外光譜技術(shù)能快速準(zhǔn)確檢測玉米DDGS的水分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪。周昊杰等[57]利用便攜式近紅外儀掃描苜蓿干草和玉米青貯樣品，建立了苜蓿干草、玉米青貯主要營養(yǎng)成分的近紅外數(shù)據(jù)庫。Hetta等[58]利用高精度近紅外光譜儀和偏最小二乘回歸模型的近紅外高光譜成像技術(shù)對不同成熟度的玉米飼料進(jìn)行評價，結(jié)果顯示，各變量預(yù)測效果顯著，這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步將該技術(shù)應(yīng)用于建模和飼料評價開辟了新的可能性。Sagrario等[59]利用兩種手持式近紅外儀采集復(fù)合飼料的光譜數(shù)據(jù)，結(jié)合化學(xué)測量值建立預(yù)測模型。結(jié)果顯示，對于PhIR儀器，CP、CF、淀粉（STCH）的交叉驗(yàn)證測定系數(shù)分別為0.90、0.85、0.89；對于MICRO儀器，CP、CF、STCH的交叉驗(yàn)證測定系數(shù)分別為0.89、0.91、0.91，且RPD各參數(shù)的值均大于2.2。研究結(jié)果表明，此研究兩種手持近紅外儀器在檢測復(fù)合飼料營養(yǎng)成分方面具有潛力。

高光譜技術(shù)同時包含了光譜信息和圖像信息[60]。其中，圖像信息可以顯示成像對象在特定波長上由于其相應(yīng)化學(xué)成分的分布而產(chǎn)生的不同光譜強(qiáng)度。而光譜信息可以被認(rèn)為是該像素特有的光譜指紋，用以表征該特定像素的組成[61]。付苗苗等[62]利用高光譜成像儀采集配合飼料樣本的圖像光譜信息，建立飼料營養(yǎng)成分定量分析模型。結(jié)果顯示，粗蛋白、粗灰分的分析模型預(yù)測性能較好，兩者驗(yàn)證集決定系數(shù)、均方根誤差、相對分析誤差分別為0.777 8、2.615 5%、2.114 3和0.775 8、1.061 1%、2.120 4。

3 典型快速檢測設(shè)備

對于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的檢測必須快速、準(zhǔn)確且可以現(xiàn)場實(shí)時檢測。鑒于此，許多公司都在加快研究檢測設(shè)備的進(jìn)度，目前，已有公司生產(chǎn)用以檢測飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的設(shè)備，營養(yǎng)物質(zhì)的典型快速檢測設(shè)備及其特點(diǎn)如表3所示。

表3 典型快速檢測設(shè)備及其特點(diǎn)

4 總結(jié)和展望

基于光譜分析的飼料營養(yǎng)成分檢測技術(shù)，有著廣泛的應(yīng)用前景，目前取得了一定的成果。同時，光譜分析技術(shù)也存在需要解決的問題，例如，光譜檢測數(shù)據(jù)庫豐富度、數(shù)據(jù)預(yù)處理和建模精度等方面還需進(jìn)一步研究。為此，課題組提出如下展望：

1）進(jìn)一步開發(fā)數(shù)據(jù)解析算法。實(shí)驗(yàn)的不確定性，還有背景的噪聲，都會帶來冗余的數(shù)據(jù)，這就需要開發(fā)更加精確的算法以用于對光譜采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和建模。算法要在不去掉樣品特征信息的同時最大化濾除噪聲帶來的干擾，并且，也可以對信號進(jìn)行多次預(yù)處理，探索各種預(yù)處理方法及其組合的可能性。

2）進(jìn)一步研發(fā)便攜式檢測儀器。目前，大多數(shù)光譜檢測營養(yǎng)物質(zhì)的過程是在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的，能夠現(xiàn)場檢測飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的設(shè)備還比較欠缺，且實(shí)驗(yàn)器材昂貴、體型大。所以，研制方便攜帶、效率高、低價位的小型光譜檢測儀是技術(shù)上需要解決的一個關(guān)鍵問題。建立針對營養(yǎng)物質(zhì)的特定光譜數(shù)據(jù)庫，可以在很大程度上簡化檢測過程。

3）進(jìn)一步提升檢測靈敏度。盡管太赫茲時域光譜技術(shù)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但阻礙其在飼料檢測中廣泛應(yīng)用的主要問題是靈敏度有限，所以，這就需要將樣品信號進(jìn)行放大處理?；诔９鈱W(xué)傳輸效應(yīng)的超材料是由周期性排列的亞波長元件組成的人造材料，有獨(dú)特的電磁特性且具有很強(qiáng)的局部化和增強(qiáng)的場，能夠靈敏地探測到極少量的化學(xué)和生物物質(zhì)?？蓪⒐庾V技術(shù)和可以提高靈敏度的超材料結(jié)合起來檢測營養(yǎng)物質(zhì)。