劉鑫行, 張殿龍, 張竟月, 孫 斌, 佟 林 趙玉曉, 鐘家棟

(1. 中國計量大學, 浙江 杭州 310018; 2.中國計量科學研究院， 北京 100029)

1 引 言

微小容量的應用廣泛,主要應用于生物制藥、醫(yī)學檢驗、化學測試等領域[1,2]。醫(yī)療分析儀的單次試劑常用移液量為100 μL[3],生化測試中聚合酶鏈式反應通常需要配制50 μL溶液[4,5],各領域需要轉(zhuǎn)移的液體容量已從毫升向微升級擴展[3,5]。微量液體的容量轉(zhuǎn)移要求較高,移液器、進樣器等由于體積小、便于攜帶成為主要計量器具[6]。在長期使用時,移液器由于彈簧形變等原因,容量失準率會增高[7],所以需要對移液器進行定期校準。目前用于液體容積檢測方法主要分為2類：重力法和非重力法。

重力法采用高精度的電子天平,是目前使用最多的方法。我國現(xiàn)今用于計量檢定的方法也是基于重力法,該方法對實驗環(huán)境要求高,很難實現(xiàn)在線測量,且高精度的電子天平價格昂貴。非重力法主要有光學法和滴定法等[8],滴定法是基于化學反應,如沉淀等計算加入液體的體積[9]。光學法可分為單波長測量和雙波長測量,對環(huán)境要求不高,可實現(xiàn)在線測量。

本文基于時域分光的模式,結(jié)合雙波長測量,提出了一種非重力法的微小容量檢測方法。該方法滿足ISO-8655的技術要求的同時,可以通過調(diào)整原液濃度和稀釋比例大大提高實驗效率,與傳統(tǒng)重力法進行比較得到了一致的結(jié)論,驗證了方法的可行性。

2 微小溶液容積測量的基本原理

為克服靜力衡量法環(huán)境要求高等問題,非重力法是目前研究的趨勢。光學法是基于溶液吸光度與溶液濃度的關系,即當一束單色平行光通過某溶液時,該溶液的吸光度A與入射光強I和透射光強I0的比值有關,見式(1)。

(1)

也可以表示為式(2),在一定條件下,吸光度與溶液的濃度c和通過溶液的光程b成正比,摩爾吸光系數(shù)K為常數(shù)。

A=Kbc

(2)

由式(2)可知,當摩爾吸光系數(shù)K和光程b一定時,吸光度僅與溶液的濃度有關。但在實際操作過程中,在使用分光光度法進行實驗時,不同的比色皿之間測得的吸光度并不一致,用單波長來測量溶液的體積很難避免加工帶來的光程誤差,所以用分光光度法進行容積檢測時可選擇雙波長測量方法[10]。

2.1 雙波長測量原理

雙波長測量時所用的2種液體要求被測原液在波長1處有吸收峰,稀釋液在波長2處有吸收峰且在波長1處沒有吸光度或吸光度接近0。被測原液體積的測量過程分為3步。

1) 標準液的吸光度測試：分別測試標準液在波長520和730 nm處的吸光度AS1及AS2,標準液的吸光度也可由式(3)獲得：

(3)

式中：R為標準液的稀釋比例,VS1和VS2分別為標準液中原液和稀釋液的體積；K1和K2分別為標準液中原液和吸釋液的摩爾吸光系數(shù)；b1，b2為光透過溶液的光程；c1，c2分別為原液和稀釋液的濃度。

2) 稀釋液的吸光度測試：在同樣2個波長處對已知體積VD的稀釋液進行吸光度測試,得到吸光度AD1和AD2,對2個吸光度做差去除背景噪聲建立零點,表達式見式(4)：

AD2-AD1=K2b2c2

(4)

3) 混合液吸光度測試：用移液器將體積為VU的原液加至步驟2)中的稀釋液,混合均勻后測量波長520 nm處的吸光度AU,同理去除背景噪聲后的表達式由式(5)表示:

(5)

聯(lián)立式(3)、式(4)和式(5),可得被測原液的體積VU如式(6)所示。

(6)

通過上述比值計算可以將比色皿的加工帶來的誤差大大減小。

JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》中要求對微小容量校準時需要校準3個測量點,每個測量點需要測量6次,若用光學法進行實驗,校準1支移液器就需要18個比色皿。

由于比色皿是一種較高精度的光學元件,校準時使用的比色皿需經(jīng)常更換。為此,本實驗對溶液濃度進行調(diào)整,保證溶液的吸光度在線性范圍內(nèi)盡可能多次試驗,提高比色皿的使用率。

以50 μL原液為例。由于實驗中稀釋液的體積VD已知,每次加入的原液體積一定,則混合液中兩者的比例確定,由式(7)可知溶液的吸光度比值等于稀釋比例的比值,式(7)中A1、A2和R1、R2分別為稀釋前后溶液的吸光度和稀釋比例，K為溶液的摩爾吸光系數(shù)，c為溶液的濃度，l為比色皿的寬度。若要保證溶液的吸光度多次在0.2～0.8內(nèi),按稀釋比例間的比值可以獲得第i次的理論吸光度Ai,經(jīng)過計算每個比色皿最多可用3次,每次加入的原液體積由式(9)計算,其中AUi+1為第i+1次加入原液后的吸光度,Vi+1為第i+1次加入原液后的總體積,Vi為第i次的總體積。如令第一次加入原液后的吸光度A1為0.25,則A3的理論值就為0.72,A1已知可以由式(8)確定溶液的濃度。

(7)

(8)

(9)

2.2 時域分光原理

雙波長測量時需要系統(tǒng)進行分光處理獲得2種波長,系統(tǒng)的分光原理主要有時域分光和空域分光2種形式。與空域分光不同,時域分光是在時間域上分光,即復色光源在通過吸收池前先由分光系統(tǒng)進行前分光得到單色光,然后將單色光入射到被測樣品，根據(jù)溶液在該單色光下的吸光度可以計算出溶液體積,可以計算出溶液的體積?？沼蚍止庖部煞Q為后分光,即光源在進入樣品室后再由分光系統(tǒng)分光,該方法可以在同一時刻得到各個波長的單色光,實現(xiàn)空間上的波長分離。與空域分光系統(tǒng)相比,時域分光系統(tǒng)對光源的穩(wěn)定性要求較高,但光路和信號處理方式較為簡單,探測器一般選用光電二極管、光電倍增管等[10～12]。

分光元件是分光系統(tǒng)中主要的元件,常用的有棱鏡和光柵2種[13]。棱鏡分光原理是因為不同波長的光在同一介質(zhì)中折射率不同,可將復色光源分成不同波段的光譜[14]；光柵是由大量等寬等間距的平行狹縫組成的光學元件,每個狹縫都可以發(fā)生多縫衍射形成色散。

衡量分光元件的色散本領通常以角色散率和線色散率表示。從棱鏡和光柵的色散公式可知,棱鏡對短波長的色散能力更強,但棱鏡色散的非線性會大大增加光譜定標的難度。

反射光柵的色散能力與光柵常數(shù)、光譜級次和入射角有關,由于光柵常數(shù)普遍較小,光柵的色散能力較強。從波長分辨率分析,棱鏡的波長分辨率與材料色散率和自身尺寸有關,在光譜分析時可以選用底邊寬度較寬的棱鏡來提高波長分辨率[14,15]；光柵光譜的波長分辨率可由式(10)表示：

(10)

式中:λ為波長;Δλ光譜寬度。

增加光柵的狹縫數(shù)N可以提高光柵分辨率。棱鏡和光柵雖均可用于光譜分析,但光柵刻痕可以很多(即N可以很大),所以與棱鏡相比光柵光譜更精細,波長分辨率也更高[15，16]。

實驗通過雙波長測量減小了由比色皿的加工誤差帶來的影響,調(diào)整原液濃度實現(xiàn)多次測量,提高耗材利用率,并選用光柵作為分光元件設計了一套基于時域分光法的微小容量檢測系統(tǒng)。

3 實驗與數(shù)據(jù)分析

本實驗采用時域分光的原理進行微小容量檢測,其測量原理如圖1所示。

圖1所示系統(tǒng)的分光方式屬于前分光,光源從入射狹縫S1進入分光系統(tǒng),經(jīng)凹面鏡M2反射至光柵G,由光柵分光處理后從反射鏡M3和M4反射至出射狹縫S2,然后將單色光入射到樣品室中測量溶液吸光度,分光系統(tǒng)的操作波長范圍在300～800 nm,波長重復性和準確性為0.2%,所需波長可由電機控制。實驗采用的光源是20 W額定功率鎢燈,圖2是鎢燈光源在520 nm處穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù),每隔10 min測量一次電壓,數(shù)據(jù)顯示光源的穩(wěn)定性小于0.15%,能夠滿足實驗要求。探測器采用的是光電二極管,該探測器具有靈敏度高、噪聲小的特點,能夠探測微弱信號。

圖1 測量原理圖Fig.1 Basic structure of the system

圖2 光源穩(wěn)定性實驗Fig.2 Experiment of light source stability

將1支已校準的100 μL定點移液器按照上述測量過程進行實驗,實驗數(shù)據(jù)如圖3所示,根據(jù)數(shù)據(jù)計算所得的容量允許誤差E和重復性S如表1所示,結(jié)果顯示通過時域分光原理所得的溶液容量的允許誤差和重復性均在規(guī)程規(guī)定的范圍內(nèi),檢定的結(jié)果與傳統(tǒng)重力法一致。

圖3 100 μL測量點光學法和重力法對比實驗Fig.3 Comparative experiment of optical method and gravity method at 100 μL measuring point

表1 光學法和重力法在100 μL測量點的 相對誤差和重復性Tab.1 Relative error and repeatability of optical method and gravity method at 100 μL measuring point (%)

同理配制50 μL測量點多次實驗的原液濃度,取已檢定的移液器在比色皿中重復做3次試驗,實驗數(shù)據(jù)如圖4所示,根據(jù)數(shù)據(jù)計算所得的容量允許誤差E和重復性S如表2所示,數(shù)據(jù)顯示通過調(diào)整原液濃度可實現(xiàn)比色皿的重復使用,且容量的偏差和重復性均在規(guī)程的允差范圍內(nèi)。

圖4 50 μL測量點光學法和重力法對比實驗Fig.4 Comparative experiment of optical method and gravity method at 50 μL measuring point

表2 光學法和重力法在50 μL測量點的 相對誤差和重復性Tab.2 Relative error and repeatability of optical method and gravity method at 50 μL measuring point (%)

4 結(jié) 論

通過實驗數(shù)據(jù)可得出以下結(jié)論：

1) 使用時域分光法對微小溶液進行測量，能夠計算出待測溶液的體積,在100 μL測量時光學法測得的容積為99.67 μL,重復性為0.35%,所得容量的允許誤差和重復性滿足要求,為微小溶液容量計量提供了一種新的方法；

2) 本實驗對溶液的濃度進行調(diào)整,驗證了在吸光度的線性范圍內(nèi)比色皿能夠重復使用得到溶液的體積,在50 μL測量實驗中測得容積為50.11 μL,重復性為1.22%。與傳統(tǒng)重力方法的檢定結(jié)果一致；本實驗對每一個測量點均可以進行溶液濃度調(diào)整,在保證吸光度線性范圍內(nèi)可實現(xiàn)多次測量；

3) 基于時域分光原理所得溶液體積的方法與傳統(tǒng)的重力法相比,對實驗的環(huán)境要求不高,可實現(xiàn)在線測量。