馬文 杜娟 向凝 楊卉 黃逢敏 馮芳 胡全

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 1干部診療科，貴州 貴陽 550004；2呼吸與危重癥科)

血管重塑是慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征性病理改變，而肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)是血管重塑的主要效應細胞〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，PASMCs在各種理化因素刺激下，可合成分泌多種細胞因子，如單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、轉化生長因子(TGF)-β1等，在炎癥反應、氣道重塑等病理過程中發(fā)揮重要作用〔2,3〕。在哺乳動物中，Toll樣受體(TLR)4參與炎癥反應過程，但其信號通路與MCP-1、TGF-β1是否存在相關性尚未闡明〔4～6〕。本研究旨在分析COPD大鼠PASMCs中MCP-1、TGF-β1蛋白的表達情況及與TLR4的相關性，有利于進一步探究COPD的病理機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 選取北京大學醫(yī)學院實驗動物中心提供的雄性成年Wistar大鼠36只(合格證號：SCXKG 2015-0020)，SPF級，體重250～300 g，自然光照下常規(guī)飼養(yǎng)，室溫保持在23℃左右。根據(jù)隨機數(shù)字表法將其分為脂多糖(LPS)組、TLR4抑制劑組、LPS+TLR4抑制劑組和對照組各9只。實驗大鼠均健康，LPS組平均體重(232.8±7.7)g，TLR4抑制劑組平均體重(233.6±7.8)g，LPS+TLR4抑制劑組平均體重(233.1±7.6)g，對照組平均體重(232.0±7.5)g，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2實驗儀器及試劑 自制有機玻璃艙(92 cm×63 cm×43 cm)；NIB400顯微鏡(深圳市星明光學儀器有限公司)；蛋白質電泳及轉膜儀(上海艾研生物科技有限公司)；Berthold LB 942微孔板式多功能酶標儀(上海艾研生物科技有限公司)；硬包中華牌香煙(上海煙草公司出品)；胎牛血清、LPS、DMEM培養(yǎng)基、TLR4鼠單克隆抗體、β-actin小鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒及總蛋白提取試劑盒(上海撫生實業(yè)有限公司)；TAK-242(美國APExBIO公司)。

1.3實驗方法

1.3.1建立動物模型 所有實驗大鼠飼養(yǎng)1 w適應環(huán)境。于實驗第1天及第14天時通過氣道對LPS組、TLR4抑制劑組和LPS+TLR4抑制劑組大鼠注入LPS(200 μg/次)，而后放入有機玻璃艙中，采用香煙進行熏蒸，1 h/d，共煙熏8 w，艙中保持與大氣壓力相同，留有小孔與外界相通，內置少量無水氯化鈣保持干燥。對照組于第1天及第14天時通過氣道注入相同量0.9%NaCl溶液，其余無任何處理，與其余3組大鼠在相同環(huán)境中飼養(yǎng)，共8 w。

1.3.2分離培養(yǎng)并鑒定各組大鼠遠端原代PASMCs 向大鼠腹腔注射水合氯醛(100 g/L)至麻醉效果滿意，取出心肺，用75%乙醇浸泡固定5 min。解剖獲得肺動脈3級分支，剝離動脈中膜，在37℃下水浴，加入Ⅰ型膠原酶，20 min后離心去除消化酶，向其加入DMEM高糖培養(yǎng)液后培養(yǎng)(含5% CO2，37℃)。培養(yǎng)第4天時可見細胞萌出，第10天時細胞長至培養(yǎng)瓶90%，選擇達到對數(shù)生長期的第4～6代細胞進行實驗。PASMCs細胞采用免疫組化染色鑒定。

1.3.3Western印跡測定PASMCs中TLR4蛋白水平 LPS組給予LPS(1 ml/L)，TLR4抑制劑組給予TAK-242(1 μmol/L)，LPS+TLR4抑制劑組給予LPS(1 ml/L)+TAK-242(1 μmol/L)，對照組不作任何處理，各組設9個復孔。培養(yǎng)24 h，利用溶液法(RIPA裂解液)提取PASMCs總蛋白，計算上樣量并上樣。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，時間2 h；轉膜，封閉2 h，滴加1∶1 000稀釋的TLR4單抗，在4℃環(huán)境下過夜，采用TBST洗聚偏氟乙烯(PVDF)膜3次，每次約10 min；加入1∶5 000的二抗山羊抗鼠IgG，于室溫下孵育2 h，發(fā)光后通過軟件分析圖像的灰度值。

1.3.4ELISA檢測MCP-1、TGF-β1蛋白水平 細胞的分組、培養(yǎng)基樣本量同1.3.3。采用多功能酶標儀在波長595 nm處測量光密度值，制作標準曲線，再根據(jù)標本光密度值的相對位置換算MCP-1和TGF-β1蛋白濃度，操作方法嚴格參照試劑盒說明進行〔7〕。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行方差分析、獨立樣本t檢驗、Spearman相關性分析。

2 結 果

2.1COPD大鼠模型蘇木素-伊紅(HE)染色及PASMCs免疫組化染色 對照組肺泡完整，肺組織未見炎細胞浸潤；LPS組、TLR4抑制劑組和LPS+TLR4抑制劑組肺泡破裂融成肺大泡，其間伴大量炎性細胞。經(jīng)ASM-actin免疫組化染色，鏡下可見胞液中大部分肌動蛋白形成棕黃色絲狀物，平行于細胞長軸。見圖1。

圖1 各組肺組織HE染色及PASMCs免疫組化染色(×200)

2.2各組PASMCs中TLR4蛋白水平比較 各組TLR4蛋白含量由高到低依次為LPS組(2.92±0.28)、LPS+TLR4抑制劑組(1.90±0.15)、對照組(0.92±0.12)和TLR4抑制劑組(0.63±0.09)，兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖2。

2.3各組細胞培養(yǎng)上清液中MCP-1、TGF-β1蛋白水平比較 4組細胞培養(yǎng)上清液中MCP-1和TGF-β1蛋白水平由高到低依次為LPS組、LPS+TLR4抑制劑組、對照組和TLR4抑制劑組，兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

1～4：對照組，LPS組，TLR4抑制劑組，LPS+TLR4抑制劑組圖2 各組PASMCs中TLR4蛋白的表達

表1 各組MCP-1、TGF-β1蛋白水平比較

2.4TLR4與MCP-1、TGF-β1的相關性 COPD大鼠PASMCs中TLR4蛋白含量與細胞培養(yǎng)上清液中MCP-1和TGF-β1蛋白水平均無相關性(r=0.482，0.363；均P>0.05)。

3 討 論

目前，醫(yī)學界公認的COPD發(fā)病基礎為肺血管和肺實質中的慢性炎癥及血管重構，在各種理化因素的刺激下，PASMCs的表型可出現(xiàn)轉變，表達炎性因子和多種基質蛋白的能力增強，促使大量炎性細胞積聚，放大炎癥級聯(lián)反應，最終達到促使PASMCs遷移增殖和重塑肺血管的作用〔8～10〕。MCP-1可完成對巨噬細胞的趨化激活作用，從而參與炎癥反應〔11〕。TGF-β1是一種可調節(jié)細胞分化、生長的活性肽，有調節(jié)細胞生長分化的作用〔12〕。在COPD的病理過程中，TGF-β1一方面促進成纖維細胞不斷合成，另一方面抑制了細胞外基質的降解，使氣道管壁逐漸變厚，最終對患者的肺功能產(chǎn)生不可逆損害〔13〕。研究證實，COPD患者在緩解期和急性加重期MCP-1和TGF-β1均有不同程度的提高〔14〕。研究證實了MCP-1和TGF-β在COPD發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用〔15〕。TLR4蛋白可在LPS、病原微生物等多種因素刺激下，通過分泌黏附因子、趨化因子和相關細胞因子達到調節(jié)炎性反應的效果〔16〕。研究發(fā)現(xiàn)，在對細胞采用TAK-242干預后，TLR4的分泌顯著下調，但對其他細胞因子的分泌影響較小，因此被認為是TLR4的特異性抑制劑〔17〕。研究發(fā)現(xiàn)，通過氣道吸入煙霧及注入LPS可導致COPD〔18〕，本研究煙熏并向氣道注入LPS的手段制作大鼠COPD模型。

以往研究發(fā)現(xiàn)，在MCP-1的表達過程中，TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮了重要作用，這一過程是在血管平滑肌細胞中完成的。此外，通過LPS誘導體外培養(yǎng)的PASMCs，TLR4顯著表達的同時，MCP-1和TGF-β1的分泌也明顯增加〔19〕。研究報道急性加重期COPD患者的組織因子、TGF-β1和MCP-1含量均高于正常人，同時組織因子與TGF-β1、MCP-1呈顯著正相關〔20〕。

綜上，LPS可上調COPD大鼠PASMCs中TLR4蛋白的表達，并促進MCP-1和TGF-β1的分泌，但TLR4與MCP-1、TGF-β1并無顯著相關性。