姜磊 張睿 馬笑影 高肇妤 崔冬生 許順江

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室 河北省腦科學(xué)與精神心理疾病重點實驗室，河北 石家莊 050000)

miRNAs是一類長度為20～24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)〔1〕。miRNAs在阿爾茨海默病(AD)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用〔2〕，且miRNAs可能作為AD診斷的標(biāo)志及治療的新靶點〔3〕。miRNA芯片能夠克服單基因研究的缺點，在功能基因組學(xué)研究中有廣泛的用途，從整體上分析細(xì)胞或組織之間的差異。本實驗通過miRNA芯片技術(shù)，分別篩選原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元和氧化應(yīng)激的海馬神經(jīng)元及正常老化小鼠(SAMR1)和速老化小鼠(SAMP8)海馬組織差異表達(dá)的miRNAs，并對這些miRNAs進(jìn)行qPCR驗證及生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1實驗材料 3月齡SAMR1和3月齡SAMP8購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心。兩種小鼠飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動物中心。本實驗所有操作程序經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、B27均購于美國Invitrogen公司。H2O2、胰蛋白酶、左旋多聚賴氨酸、Hoechst33258購于美國SIGMA公司。甲臜化合物(MTS)購于美國Promega公司。微管相關(guān)蛋白(MAP)-2一抗購于美國BD公司。驢抗鼠熒光二抗購于美國Abbkine公司。miRcute miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒購于中國TIANGEN公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用75%乙醇浸泡消毒整個SAMR1新生鼠后，放入超凈工作臺的彎盤中斷頭取腦，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中快速分離海馬組織。將剔除腦膜和血管的海馬組織剪成1 mm3左右的碎塊。向碎塊中加入0.125% 胰酶，37℃作用10 min。加入含20%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化。接著加入含20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基制成密度為1×106個/ml的細(xì)胞懸液，并放入由0.1 g/L多聚懶氨酸包被的培養(yǎng)皿中。細(xì)胞在95% 濕度和5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基換成含2% B27的neurobasal培養(yǎng)基，接著每3 d半量換液孵育7 d。

1.2.2免疫細(xì)胞化學(xué) 用4%多聚甲醛固定體外培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元，使用0.3% TritonX-100改變細(xì)胞膜的通透性，用3%牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性抗原。加入MAP-2(1∶200)一抗，4℃孵育過夜，PBS清洗。加入TRITC標(biāo)記的熒光二抗，室溫孵育1 h。使用Hoechst33258復(fù)染核。使用熒光顯微鏡拍照。計算MAP-2陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比率，確定細(xì)胞純度。

1.2.3MTS法檢測海馬神經(jīng)元的相對存活率 接種于96孔板中培養(yǎng)7 d的原代海馬神經(jīng)元，加入不同濃度H2O2(0、100、200、400和800 μmol/L)處理24 h后，每孔加入20 μl MTS試劑，在37℃、5% CO2的環(huán)境下孵育4 h。在酶標(biāo)儀490 nm波長下讀取吸光度值。細(xì)胞存活率(%)=〔(As-Ab)/(Ac-Ab)〕×100%(As為實驗孔：含細(xì)胞的培養(yǎng)基+MTS+H2O2；Ab為空白孔：完全培養(yǎng)基+MTS；Ac為對照組：含細(xì)胞的培養(yǎng)基+MTS)。計算不同組別細(xì)胞存活率，實驗均重復(fù)3次，取其均值。

1.2.4miRNAs表達(dá)譜分析 使用miRcute miRNA 提取分離試劑盒提取200 μmol/L H2O2處理的原代海馬神經(jīng)元和未經(jīng)H2O2處理的原代海馬神經(jīng)元及3月齡SAMP8和3月齡SAMR1海馬組織總RNA(步驟按照說明書進(jìn)行)。使用Nanodrop1000分光光度計對提取的總RNA進(jìn)行定量。使用Affymetrix miRNAs芯片 GeneChip miRNAs 2.0 Array分析miRNAs的表達(dá)。

1.2.5實時定量PCR 使用miRcute miRNA 提取分離試劑盒提取200 μmol/L H2O2處理的海馬神經(jīng)元和未經(jīng)H2O2處理的海馬神經(jīng)元及3月齡SAMP8和3月齡SAMR1海馬組織總miRNAs。使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)cDNA的合成，使用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒進(jìn)行qPCR檢測，以miRNA-U6作為內(nèi)參。實驗步驟按照說明書進(jìn)行：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，40個循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線檢測特異性。

1.2.6生物信息學(xué)分析 使用miRDB數(shù)據(jù)庫(http://www.mirdb.org/)和Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測兩組芯片共表達(dá)的差異miRNAs的靶基因，取其合集，并利用DAVID生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對預(yù)測的靶基因進(jìn)行基于基因功能聚類(GO) 的功能富集分析及基于京都基因與基因組百科全書(KEGG)的生物通路富集分析(P<0.05)，錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.001視為有價值)。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算miRNA的表達(dá)。采用GraphPad Prism version 5.0和Excel進(jìn)行作圖。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗，方差分析，SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1H2O2處理濃度依賴地抑制海馬神經(jīng)元的存活率 免疫熒光染色結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元純度大于95%。細(xì)胞胞體飽滿，突起粗大相互交織成網(wǎng)絡(luò)狀，說明海馬神經(jīng)元處于最佳狀態(tài)，適用于實驗(圖1)。用不同濃度(0、100、200、400、800 μmol/L)的H2O2刺激海馬神經(jīng)元24 h，MTS結(jié)果顯示，海馬神經(jīng)元存活率分別為(100.0±2.8)%、(89.6±4.8)%、(66.6±6.3)%、(60.0±4.9)%、(39.8±7.1)%。其中200 μmol/L 的H2O2處理海馬神經(jīng)元24 h后，存活率顯著降低(P<0.01)。因此，在后續(xù)實驗中，以200 μmol/L H2O2誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元制備體外氧化應(yīng)激模型。

圖1 免疫細(xì)胞染色分析原代海馬神經(jīng)元純度

2.2氧化應(yīng)激介導(dǎo)的AD相關(guān)miRNAs的篩選 miRNA芯片分析結(jié)果顯示，與原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元相比，氧化應(yīng)激的海馬神經(jīng)元中101個miRNAs表達(dá)改變，其中64 個表達(dá)上調(diào)，37個表達(dá)下調(diào)。與SAMR1鼠相比，SAMP8鼠海馬組織中294個miRNAs表達(dá)改變，其中131個表達(dá)上調(diào)，163個表達(dá)下調(diào)。其中有6個差異表達(dá)的miRNAs (miR-296、miR-20a、miR-329、miR-193b、miR-130b和miR-24)在體外氧化應(yīng)激的海馬神經(jīng)元和SAMP8鼠海馬組織中表達(dá)的miRNAs中表達(dá)均上調(diào)，而miR-376b則在兩種模型基因芯片結(jié)果中表達(dá)均下調(diào)。

2.3氧化應(yīng)激介導(dǎo)的AD相關(guān)miRNAs的表達(dá) 與對照組相比，200 μmol/L H2O2處理的海馬神經(jīng)元中miR-329(1.024±0.256 vs 2.244±0.742，P<0.05)、miR-193b(1.011±0.176 vs 3.611±0.329，P<0.01)、miR-20a(1.009±0.165 vs 3.470±0.297，P<0.01)、miR-296(1.023±0.235 vs 4.127±0.735，P<0.01)、miR-130b(1.003±0.083 vs 2.238±0.733，P<0.05)和miR-24(1.012±0.173 vs 2.508±0.355，P<0.01)表達(dá)量明顯上升，miR-376b(1.019±0.228 vs 0.448±0.062，P<0.01)表達(dá)量明顯下降。與SAMR1比較，SAMP8海馬組織miR-329(1.021±0.238 vs 2.562±0.839，P<0.05)、miR-193b(1.033±0.308 vs 2.369±0.253，P<0.01)、miR-20a(1.007±0.147 vs 3.098±0.550，P<0.01)、miR-296(1.017±0.208 vs 1.817±0.225，P<0.01)、miR-130b(1.010±0.166 vs 2.449±0.508，P<0.01)和miR-24(1.005±0.113 vs 2.185±0.842，P<0.05)表達(dá)量明顯上升，miR-376b(1.008±0.142 vs 0.385±0.107，P<0.01)表達(dá)量明顯下降。Real-time PCR 結(jié)果與miRNA芯片結(jié)果一致。

2.4差異表達(dá)miRNAs靶基因的GO富集分析和KEGG分析 miRDB數(shù)據(jù)庫和Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示兩組芯片共同表達(dá)的差異miRNAs共調(diào)控1 443個靶基因。GO富集分析結(jié)果顯示，這些靶基因主要參與細(xì)胞核的組成、蛋白質(zhì)的結(jié)合和DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控(圖2)。將預(yù)測的靶基因向KEGG數(shù)據(jù)庫映射，結(jié)果顯示這些靶基因可能參與神經(jīng)發(fā)育、MAPK信號通路和內(nèi)吞作用等(圖3)。

圖2 差異表達(dá) miRNAs靶基因的GO分析

圖3 差異表達(dá) miRNAs靶基因的KEGG分析

3 討 論

60歲以上的老年人中AD的發(fā)病率可高達(dá)2%～3%〔4,5〕。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激是公認(rèn)的AD的發(fā)病機制之一，在AD的整個病程進(jìn)展中中樞神經(jīng)系統(tǒng)均暴露于氧化應(yīng)激條件下。Feng等〔6〕發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激不僅直接參與了AD的發(fā)病，更重要的是通過級聯(lián)酶促反應(yīng)放大了AD神經(jīng)變性的發(fā)生。此外，氧化應(yīng)激在AD發(fā)病和進(jìn)展過程中可導(dǎo)致基因表達(dá)失調(diào)。其中包括miRNAs在內(nèi)的非編碼RNA，在AD等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病過程中的調(diào)控作用逐漸成為近年來的研究熱點〔7,8〕。miRNAs主要通過調(diào)節(jié)其下游靶基因的方式，在AD的發(fā)病中發(fā)揮作用〔9〕。梁厚成等〔10〕發(fā)現(xiàn)，氧化損傷引起視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中 miR-31等17個miRNAs的表達(dá)隨H2O2濃度升高呈逐漸降低的趨勢。Ansari等〔11〕發(fā)現(xiàn)，miR-146a和miR-181a參與輕度認(rèn)知障礙和AD的發(fā)生發(fā)展。

共表達(dá)可能來源于共調(diào)節(jié)，共表達(dá)分析可為研究不同miRNAs功能提供更重要的信息。SAMP8主要特征表現(xiàn)為與衰老相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶障礙，具有β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、腦萎縮生等病理變化，并且在行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)及分子水平方面均表現(xiàn)出一定的衰老變化，是目前研究腦老化理想的動物模型〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，SAMP8在4月齡時出現(xiàn)Tau蛋白異常磷酸化和Aβ沉積，7月齡時出現(xiàn)嚴(yán)重的認(rèn)知功能受損，因此以SAMP8作為AD動物模型〔13〕。而利用H2O2處理細(xì)胞制備的體外模型已被廣泛應(yīng)用氧化應(yīng)激機制研究。本研究將動物模型和體外細(xì)胞模型結(jié)合起來分析共同表達(dá)的差異miRNAs，能更精確篩選出與氧化應(yīng)激相關(guān)，并在AD的發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用的miRNAs。有研究表明，miR-130b、miR-20a、miR-24和miR-329均對腦的發(fā)育和神經(jīng)元的分化具有重要的調(diào)節(jié)作用〔14～17〕。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和AD動物模型海馬組織中miR-130b、miR-20a、miR-24、和miR-329均表達(dá)上調(diào)。劉辰庚等〔18〕發(fā)現(xiàn)在AD患者和輕度認(rèn)知障礙患者血清外吐小體中miR-193b的表達(dá)較對照組降低。其結(jié)果與本研究中miR-193b在氧化應(yīng)激和AD動物模型海馬組織中表達(dá)上調(diào)的結(jié)果不符，可能由于標(biāo)本來源不同所致。此外，本研究篩選出的差異miR-296和miR-376b尚未見其在氧化應(yīng)激、衰老和神經(jīng)元變性疾病中發(fā)揮作用的報道。研究顯示，在AD患者腦神經(jīng)元中表達(dá)下降的基因數(shù)目是表達(dá)上升基因數(shù)目的3倍〔19〕。由于miRNAs主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，因此上述AD患者腦神經(jīng)元中表達(dá)下降的基因可能受某些上調(diào)miRNAs的調(diào)控。本研究篩選出的兩組芯片共同表達(dá)改變的miRNAs以上調(diào)表達(dá)為主，因此，推測這些上調(diào)miRNAs通過下調(diào)某些基因表達(dá)參與AD的發(fā)生發(fā)展。通過GO和pathway功能分析發(fā)現(xiàn)兩組芯片共同表達(dá)改變的miRNAs靶基因可能參與細(xì)胞核的組成、蛋白質(zhì)的結(jié)合和DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多個生物學(xué)過程，并通過神經(jīng)發(fā)育、p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路和內(nèi)吞作用等通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。為闡明共同表達(dá)改變miRNAs的生物學(xué)功能及可能的通路提供有價值的信息。在AD發(fā)病中的作用機制提供實驗依據(jù)。