王志剛 申改青 黃玉煥

（南陽市第一人民醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室，河南南陽 473200）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一種特殊類型的哮喘，臨床上以咳嗽為主要癥狀甚至是唯一癥狀。在學(xué)齡前期和學(xué)齡期兒童中常見，以反復(fù)發(fā)作和遷延不愈為特點(diǎn)。因此探索CVA的發(fā)病機(jī)制，合理治療對避免CVA發(fā)展為典型哮喘具有一定幫助。近年來，T輔助細(xì)胞反應(yīng)的不平衡一直受到關(guān)注，T輔助細(xì)胞分為兩大類，Th1和Th2［1］。Th1細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2、干 擾 素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF），它們參與細(xì)胞感染的防御機(jī)制［2］。Th2細(xì)胞主要分泌的細(xì)胞因子有IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，參與過敏性炎癥反應(yīng)［3］。然而，在哮喘患者中觀察到Th1/Th2失衡，Th2過度反應(yīng)使其分泌的細(xì)胞因子增多，引發(fā)一連串免疫激活反應(yīng)，導(dǎo)致IgE產(chǎn)生增加，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的生長和分化及黏液分泌增加，誘發(fā)氣道炎癥［4］。有研究顯示，葉乙醇提取物通過抑制過敏性哮喘小鼠模型中的核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和組胺分泌，調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡，從而減輕小鼠氣道炎癥反應(yīng)［5］。間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基通過調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞向Th1/Th2效應(yīng)細(xì)胞分化，可緩解卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘反應(yīng)［6］。這些研究表明調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡可能是治療CVA的一種新穎策略。

Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（Runt-related transcription factor 3，RUNX3）由高度保守且結(jié)構(gòu)相似的RUNX基因家族編碼，分布于外周血和免疫系統(tǒng)中，RUNX3蛋白表達(dá)失衡與多種疾病有關(guān)［7-9］。RUNX3在T細(xì)胞發(fā)育中具有關(guān)鍵功能，參與T輔助細(xì)胞分化，具有增強(qiáng)IFN-γ分泌和抑制IL-4分泌的雙重作用，還可作用于T細(xì)胞的分化，影響Th1/Th2的平衡［10］。因此RUNX3對Th1/Th2平衡具有一定調(diào)節(jié)作用，有可能成為治療哮喘的潛在靶點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miR）是18～22個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，是基因表達(dá)的微妙調(diào)控因子，在多種疾病中發(fā)揮作用，尤其是在慢性多因素疾病如哮喘［11］。有研究顯示，miR-138在哮喘中可調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的Th2型免疫反應(yīng)，參與哮喘的發(fā)病［12］。另有研究顯示在銀屑病中miR-138可通過靶向調(diào)節(jié)RUNX3的表達(dá)影響Th1/Th2的平衡［13］。因此本文探討miR-138和RUNX3對CVA Th1/Th2平衡的影響，并進(jìn)一步分析二者間是否具有靶向作用，為CVA的臨床治療提供方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2019年1月至2021年1月在我院接受治療的CVA患兒65例納入CVA組，其中男35例，女30例，年齡（8.7±2.6）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）CVA患兒的診斷符合《中國兒童慢性咳嗽診斷與治療指南（2013年修訂）》［14］；（2）均為首次確診患兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并肺結(jié)核或肺部感染；（2）合并免疫性疾病或過敏性疾??；（3）近期服用過免疫抑制劑或抗生素；（4）合并血液系統(tǒng)疾?。唬?）合并腫瘤。同期選取健康受試者30例納入健康對照組，排除近3個(gè)月有呼吸道感染史或有哮喘史的兒童，其中男18例，女12例，年齡（7.3±2.0）歲。兩組兒童性別構(gòu)成比和年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（20181576），家屬知情同意。

1.2 外周血中CD4+T細(xì)胞的分離培養(yǎng)

收集CVA組和健康對照組兒童外周靜脈血樣本，乙二胺四乙酸抗凝后保存待用。通過Ficoll分離液溶液（北京索萊寶科技有限公司）梯度離心分離外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），利用RPMI培養(yǎng)基洗滌并重懸于RPMI培養(yǎng)基中。然后將PBMC與抗CD4+單克隆抗體的磁珠包被，分離CD4+T細(xì)胞，采用完全T細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素，50μmol/Lβ-巰基乙醇，100 U/mL IL-2）培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞。

1.3 ELISA法檢測IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-13水平

收集CVA組和健康對照組兒童CD4+T細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-13的濃度。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測Th1和Th2細(xì)胞所占比例

收集CVA組和健康對照組CD4+T細(xì)胞，加入10μL IFN-γ或IL-4細(xì)胞因子，促進(jìn)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞分化，放置恒溫箱中孵育4 h。加入10μL CD3-PC5和CD8-PC7單克隆抗體，室溫避光孵育15 min。加入固定液，再次放置15 min。加入3 mL PBS溶液，3 000 r/min離心5 min，棄上清。加入10μL IL-4-藻紅蛋白單克隆抗體、IFN-γ-異硫氰酸熒光素單克隆抗體避光孵育15 min。各管加入3 mL PBS，3 000 r/min離心5 min，棄上清。0.5 mL PBS溶液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測Th1、Th2細(xì)胞百分比。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測CD4+T細(xì)胞中RUNX3 mRNA的表達(dá)水平

利用TRIzol試劑（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）提取CD4+T細(xì)胞的總RNA。根據(jù)TaKaRa RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司）說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：37℃15 min，85℃5 s。以cDNA為模板，RUNX3上游引物序列5'-UACCGACCGAGCACAUCCAU-3'，下游引物序列5'-AGCCGCGAGGACUCGAUCCU-3'；以管家基因U6 mRNA水平作為內(nèi)參照，U6上游引物序列5'-UCAAGCACGAUCAUGAU-3'，下游引物序列5'-GUCAAGUUAGGUCGGUA-3'。按照TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司）說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.6 Western blot檢測CD4+T細(xì)胞中RUNX3蛋白表達(dá)水平

提取CD4+T細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)BCA蛋白定量，取30μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離。將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。1%BSA室溫封閉2 h，加入anti-RUNX3或anti-β-actin抗體（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。次日，加入相對應(yīng)的二抗（1∶4 000稀釋），室溫孵育1 h。滴加化學(xué)發(fā)光劑，在Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)中拍照曝光。RUNX3蛋白表達(dá)水平以RUNX3蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值表示。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

Starbase數(shù)據(jù)庫顯示，miR-138基因序列中GUGGUCG堿基與RUNX33'UTR野生型（wild type，WT）基因序列中CACCAGC堿基配對，形成沉默復(fù)合體，阻礙RUNX3基因轉(zhuǎn)錄翻譯，降低RUNX3蛋白表達(dá)水平；RUNX33'UTR突變型（mutation type，MUT）基因序列中與miR-138基因序列互補(bǔ)配對的堿基突變?yōu)镃GUAUCG（圖1）。根據(jù)RUNX3突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)WT和MUT熒光素酶報(bào)告載體，分別設(shè)置RUNX3 WT組、RUNX3 WT+miR-138 mimic組、RUNX3 MUT組和RUNX3 MUT+miR-138 mimic組，各組對應(yīng)加入RUNX3 WT熒光素酶報(bào)告載體、RUNX3 WT熒光素酶報(bào)告載體+miR-138 mimic、RUNX3 MUT熒光素酶報(bào)告載體、RUNX3 MUT熒光素酶報(bào)告載體+miR-138 mimic。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑輔助共轉(zhuǎn)染至CD4+T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，PBS清洗1次，每孔加入100μL裂解液，室溫震蕩10 min，收集細(xì)胞裂解液。每組取20μL細(xì)胞裂解液與10μL熒光素酶檢測試劑快速混勻后，用生物發(fā)光檢測儀檢測各組熒光值。

圖1 miR-138靶向調(diào)節(jié)RUNX3

1.8 RUNX3-mimic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CVA組CD4+T細(xì)胞

將CD4+T細(xì)胞接種于6孔板中，每孔40萬個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為對照組、NC-mimic組和RUNX3-mimic組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，參照Lipofectamine 2000說明書，NC-mimic組和RUNX3-mimic組分別轉(zhuǎn)染NC-mimic（對照質(zhì)粒）、RUNX3-mimic質(zhì)粒，對照組不予轉(zhuǎn)染（質(zhì)粒均由湖南豐暉生物科技有限公司合成）。轉(zhuǎn)染6 h后，更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞，采用Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。然后檢測對照組、NCmimic和RUNX3-mimic組間IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-13水平及Th1、Th2細(xì)胞比例。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組間Th1、Th2細(xì)胞比例及其分泌主要細(xì)胞因子水平變化

CVA組與健康對照組相比，Th1分泌的主要細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2水平降低，Th2分泌的主要細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平增加（P<0.001）。CVA組Th1細(xì)胞比例和Th1/Th2比值低于健康對照組，Th2細(xì)胞比例高于健康對照組（P<0.05）。見表1。

表1 兩組間Th1、Th2細(xì)胞比例及其分泌主要細(xì)胞因子水平比較 （±s）

表1 兩組間Th1、Th2細(xì)胞比例及其分泌主要細(xì)胞因子水平比較 （±s）

注：［IFN-γ］干擾素-γ；［IL］白細(xì)胞介素。

組別健康對照組CVA組t值P值Th1/Th2 4.2±1.2 1.2±0.3 4.263 0.005 n 30 65 IFN-γ(ng/L)564±62 322±24 23.652<0.001 IL-2(ng/L)305±32 174±21 32.145<0.001 IL-4(ng/L)136±14 252±18 15.214<0.001 IL-5(ng/L)126±16 284±21 18.325<0.001 IL-13(ng/L)176±15 326±28 20.625<0.001 Th1(%)8.4±1.6 3.8±0.5 8.201<0.001 Th2(%)1.5±0.4 2.3±0.8 3.652 0.026

2.2 兩組外周血CD4+T細(xì)胞RUNX3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平變化

CVA組外周血CD4+T細(xì)胞RUNX3 mRNA相對表達(dá)水平為0.42±0.10，低于健康對照組（3.14±0.16，t=8.251，P<0.001）。CVA組外周血中CD4+T細(xì)胞RUNX3蛋白相對表達(dá)水平為0.14±0.03，低于健康對照組（1.16±0.12，t=5.965，P<0.001），見圖2。

圖2 Western blot檢測兩組外周血CD4+T細(xì)胞RUNX3蛋白表達(dá)電泳圖

2.3 CVA組miR-138的表達(dá)水平及與RUNX3的靶向調(diào)節(jié)作用

CVA組miR-138的相對表達(dá)水平為2.35±0.21，高于健康對照組（0.41±0.07，t=6.458，P<0.001）。RUNX3 WT組、RUNX3 WT+miR-138 mimic組、RUNX3 MUT組和RUNX3 MUT+miR-138 mimic組間相對熒光素酶活性分別為1.02±0.23、0.42±0.09、1.10±0.12、1.07±0.18，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.251，P<0.001）。RUNX3 WT+miR-138 mimic組相對熒光素酶活性低于RUNX3 WT組（P=0.008），而RUNX3 MUT組和RUNX3 MUT+miR-138 mimic組相對熒光素酶活性與RUNX3 WT組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 增加CD4+T細(xì)胞中RUNX3的表達(dá)對Th1/Th2及其分泌的主要細(xì)胞因子的影響

對照組、NC-mimic組和RUNX3-mimic組的RUNX3蛋白灰度值分別為0.56±0.12、0.62±0.14和1.52±0.17，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.634，P<0.001），且RUNX3-mimic組RUNX3蛋白灰度值高于對照組和NC-mimic組（P<0.001）（圖3）。與對照組和NC-mimic組相比，RUNX3-mimic組中IFN-γ和IL-2水平升高，IL-4、IL-5和IL-13水平降低，Th1細(xì)胞比例和Th1/Th2比值增加，Th2比值細(xì)胞比例降低（P<0.05），見表2。

表2 增加CD4+T細(xì)胞中RUNX3的表達(dá)對Th1/Th2及其分泌主要因子的影響 （n=3，±s）

表2 增加CD4+T細(xì)胞中RUNX3的表達(dá)對Th1/Th2及其分泌主要因子的影響 （n=3，±s）

注：［IFN-γ］干擾素-γ；［IL］白細(xì)胞介素。a示與對照組和NC-mimic組相比，P<0.05。

組別對照組NC-mimic組RUNX3-mimic組F值P值Th1/Th2 1.2±0.5 1.2±0.4 3.8±1.0a 4.210 0.006 IFN-γ(mg/L)307±17 315±19 378±25a 11.251<0.001 IL-2(mg/L)186±15 180±18 284±19a 15.654<0.001 IL-4(mg/L)236±18 248±16 124±14a 16.632<0.001 IL-5(mg/L)282±15 276±22 140±19a 17.625<0.001 IL-13(mg/L)275±17 270±18 147±13a 18.142<0.001 Th1(%)3.2±0.8 3.5±0.9 7.3±1.8a 6.625<0.001 Th2(%)2.1±0.4 2.3±0.6 1.7±0.4a 3.854 0.010

圖3 Western blot法檢測各組CD4+T細(xì)胞中RUNX3蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

眾所周知，Th1/Th2細(xì)胞失衡及其分泌的細(xì)胞因子與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。在生理?xiàng)l件下，Th1和Th2細(xì)胞之間存在動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)這種平衡被打破時(shí)，會誘發(fā)哮喘發(fā)生［15］。Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13，它們可增加血清中的IgE水平并募集嗜酸性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)［16］。Th1細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2可拮抗Th2誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)并抑制哮喘的發(fā)展［17］。本研究發(fā)現(xiàn)CVA組的IL-2和IFN-γ水平低于健康對照組，而IL-4、IL-5和IL-13水平高于健康對照組，表明CVA患兒存在Th1/Th2細(xì)胞失衡。通過提高Th1細(xì)胞水平同時(shí)抑制Th2細(xì)胞水平以恢復(fù)Th1/Th2平衡，應(yīng)該是治療哮喘的有效策略。已有研究顯示，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子失衡可以減輕哮喘的炎癥反應(yīng)［15-18］。目前調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡的主要為化學(xué)藥物制劑，在本研究中主要探討miRNA對Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)作用。因?yàn)閙iRNAs具有獨(dú)特的特性，且易于合成和操作，在治療疾病方面具有一定優(yōu)勢，另外其在哮喘中起著不可或缺的作用。

本研究中，CVA組miR-138的表達(dá)水平高于健康對照組，推測其可能參與哮喘的發(fā)病。以往有研究顯示在銀屑病中，miR-138可靶向調(diào)節(jié)RUNX3，緩解Th1/Th2的失衡［13］。在本研究中通過熒光素酶活性試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示miR-138亦可直接靶向調(diào)節(jié)RUNX3。通常miRNAs通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因來發(fā)揮作用，因此值得尋找miRNA相關(guān)的靶基因，并分析其對Th1、Th2的影響，為CVA的治療提供方向。以往有研究顯示miRNAs參與氣道重塑誘發(fā)支氣管哮喘發(fā)?。?9-22］。然而miR-138靶向調(diào)節(jié)RUNX3后對Th1/Th2平衡是否存在影響，本研究通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)增加RUNX3的表達(dá)水平后可改善Th1/Th2失衡，表明RUNX3對Th1/Th2平衡有一定調(diào)節(jié)作用。RUNX3對Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)可能的作用機(jī)制如下：在Th1細(xì)胞分化過程中，RUNX3在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)增加，并以正反饋方式作用于T-bet轉(zhuǎn)錄因子［23］。T-bet是Th1細(xì)胞分化和IFN-γ分泌的啟動(dòng)子，同時(shí)抑制Th2相關(guān)的免疫事件［24］。另有研究表明RUNX3可以減弱Th2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，后者是Th2分化的主要調(diào)節(jié)因子，并且是Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所必需的［13］。

綜上所述，CVA患兒存在Th1/Th2失衡、miR-138表達(dá)水平增加，RUNX3表達(dá)水平降低，miR-138可直接靶向調(diào)節(jié)RUNX3。增加RUNX3的表達(dá)水平后可改善Th1/Th2失衡，為CVA的治療提供新的方向。