朱奕月 吳日暖 李霞 陳祥碧

（1.三亞市婦幼保健院兒科，海南三亞 572000；2.三亞市人民醫(yī)院兒科，海南三亞 572000）

急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種兒童最常見的惡性腫瘤，臨床表現(xiàn)主要有貧血、感染及發(fā)熱等，其發(fā)生與基因突變、染色體變異及功能蛋白表達異常等多種因素和機制有關［1］。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類含有18～24個核苷酸的非編碼RNA，可特異性調節(jié)生物細胞的增殖、分化、凋亡及腫瘤發(fā)生過程中相關基因表達，其異常表達與ALL的發(fā)生發(fā)展、臨床表現(xiàn)及預后情況密切相關，有望作為ALL的診斷性標志物和治療靶點［2-3］。有研究認為，miR-922及miR-506在ALL患者中存在異常表達，其表達水平變化對ALL的發(fā)生發(fā)展有重要的影響，可能是ALL預后預測及療效監(jiān)測的新指標［4-5］。然而，關于miR-922及miR-506能否作為兒童ALL診斷及預后判斷的新型生物學指標，目前尚未明確。因此，本研究通過檢測ALL患兒血清miR-922及miR-506表達水平，分析其與兒童ALL臨床指標的關系，探討miR-922及miR-506在兒童ALL診斷及預后判斷中的價值，旨在為兒童ALL的診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取2018年1月至2020年11月三亞市婦幼保健院和三亞市人民醫(yī)院收治的初診ALL患兒132例為研究對象，其中男82例，女50例，確診年齡3～14歲，平均年齡（6.5±1.8）歲。納入標準：（1）ALL的診斷及分型標準參考《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議（第四次修訂）》［6］；（2）ALL患兒均采用中國兒童白血病協(xié)作組（Chinese Children's Leukemia Group，CCLG）-ALL2008方案［7］治療。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病及自身免疫疾??；（2）確診時已接受過治療，不能配合本次研究者。根據(jù)CCLG-ALL 2008方案的危險度分層標準，將132例ALL患兒分為標危42例，中危56例，高危34例。另招募自愿參與本研究的健康兒童80例作為健康對照組，其中男53例，女27例，年齡5～14歲，平均年齡（6.9±1.4）歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準后開展，并簽署知情同意書。

1.2 隨訪方法

通過電話或門診等方式對患兒進行隨訪，隨訪截止時間為2021年5月1日?？偵妫╫verall survival，OS）期指自確診第1天至患兒死亡的時間。無進展生存（progression-free survival，PFS）期指自確診第1天至復發(fā)或由于疾病進展導致患兒死亡的時間。記錄患兒初診時的臨床基線資料、白細胞計數(shù)、血紅蛋白、融合基因類型、染色體核型及潑尼松反應情況等。

1.3 miR-922及miR-506檢測

所有患兒確診當天和健康對照組兒童體檢當天采集靜脈血3 mL，3 000 r/min，離心10 min分離血清。應用TRIzol法提取總RNA。采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription逆轉錄試劑盒（美國Life Technologies公司）以RNA為模板逆轉錄為cDNA。以U6為內參；miR-922上游引物：5'-ATCGACTATCATCACTGTCA-3'，下游引物：5'-GAGTCACTGTCGATGTGCAT-3'；miR-506上游引物：5'-GCATCGATCAGCAGTATCAG-3'，下游引物：5'-ACTAGTCATAGTCGTACTTG-3'，由上海生工生物有限公司設計并合成。在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進行擴增。PCR反應體系為20μL：1μL引物及探針Mix（20×），10μL TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33μL反向轉錄脫氧核糖核酸，7.67μL雙蒸餾水。PCR反應條件為：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火60 s，45個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算miR-922及miR-506表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗。計數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析miR-922及miR-506對兒童ALL診斷的價值。單因素生存分析應用Kaplan-Meier法，生存率比較行l(wèi)og-rank檢驗，多因素生存分析應用COX回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ALL組和健康對照組血清miR-922及miR-506表達水平變化

ALL組血清miR-922及miR-506表達水平均明顯高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001），見表1。

表1 ALL組和健康對照組血清miR-922及miR-506表達水平比較 （±s）

表1 ALL組和健康對照組血清miR-922及miR-506表達水平比較 （±s）

組別健康對照組ALL組t值P值n 80 132 miR-922 0.86±0.27 2.35±0.93 13.628<0.001 miR-506 1.04±0.38 3.72±1.36 19.165<0.001

2.2 miR-922及miR-506對兒童ALL診斷的價值

血清miR-922表達水平診斷兒童ALL的最佳截斷值為1.46，曲線下面積為0.842（95%CI：0.785～0.904），其靈敏度為86.2%，特異度為80.3%，約登指數(shù)為0.665。血清miR-506表達水平診斷兒童ALL的最佳截斷值為2.17，曲線下面積為0.875（95%CI：0.812～0.936），其靈敏度為88.5%，特異度為83.7%，約登指數(shù)為0.721。見圖1。

圖1 miR-922及miR-506診斷兒童ALL的ROC曲線

2.3 miR-922及miR-506表達與ALL患兒臨床特征的關系

以miR-922=1.46及miR-506=2.17為界值，將132例ALL患兒分為高表達miR-922組（miR-922≥1.46，n=87）和 低 表 達miR-922組（miR-922<1.46，n=45）；高表達miR-506組（miR-506≥2.17，n=92）和低表達miR-506組（miR-506<2.17，n=40）。miR-922及miR-506高表達組患兒的淋巴結腫大、白細胞計數(shù)≥50×109/L、中高危險度分層、MLL基因重排、染色體核型異常的發(fā)生率均明顯高于miR-922及miR-506低表達組（P<0.05），見表2。

表2 （續(xù)）

表2 miR-922及miR-506表達與ALL患兒臨床特征的關系 ［例（%）］

2.4 miR-922及miR-506表達與ALL患兒預后不良的關系

132例ALL患兒隨訪時間為5～27個月，中位隨訪時間為12.4個月，中位生存時間為18.5個月。生存分析顯示，miR-922高表達組患兒中位生存時間為17.2個月，miR-922低表達組患兒中位生存時間為19.6個月；miR-922高表達組患兒OS率明顯低于miR-922低表達組（χ2=10.172，P=0.001）；miR-922高表達組患兒PFS率明顯低于miR-922低表達組（χ2=8.473，P=0.006）（圖2）。miR-506高表達組患兒中位生存時間為15.7個月，miR-506低表達組患兒中位生存時間為20.8個月；miR-506高表達組患兒OS率明顯低于miR-506低表達組（χ2=14.613，P<0.001）；miR-506高表達組患兒PFS率明顯低于miR-506低表達組（χ2=11.508，P<0.001）（圖3）。

圖2 miR-922高表達組與低表達組ALL患兒的OS率及PFS率比較

圖3 miR-506高表達組與低表達組ALL患兒的OS率及PFS率比較

2.5 ALL患兒預后不良的多因素COX回歸分析

將淋巴結腫大、白細胞計數(shù)、危險度分層、MLL基因重排、染色體核型、miR-922及miR-506等自變量納入ALL患兒預后不良的多因素COX回歸分析，結果顯示：白細胞計數(shù)≥50×109/L的患兒預后不良的發(fā)生風險是白細胞計數(shù)<50×109/L患兒的1.985倍（P<0.05），危險度分層為中高危的患兒預后不良的發(fā)生風險是標危患兒的2.485倍（P<0.05），有MLL基因重排患兒預后不良的發(fā)生風險是無MLL基因重排患兒的3.715倍（P<0.05），miR-922≥1.46的患兒預后不良的發(fā)生風險是miR-922<1.46患兒的2.113倍（P<0.05），miR-506≥2.17的患兒預后不良的發(fā)生風險是miR-506<2.17患兒的2.854倍（P<0.05），見表3。

表3 ALL患兒預后不良的多因素COX回歸分析

3 討論

近年來，隨著醫(yī)學技術的不斷發(fā)展，使得我們能較好地對ALL進行診斷、風險分層和指導治療，兒童ALL生存率也有了很大的提高，但仍有20%～30%的兒童ALL在治療后出現(xiàn)復發(fā)，且復發(fā)患兒治療難度大，預后較差，嚴重影響了患兒的生存狀況［8］。因此，找到指導ALL診斷及預后判斷的靈敏度和特異度高的新型生物學指標對ALL的治療具有重大價值。miRNA是一類高度保守的非蛋白編碼的單鏈RNA分子，通過參與白血病細胞激活、增殖、分化、凋亡及信號通路轉導，在白血病的發(fā)生發(fā)展和預后中起到關鍵作用，對白血病的診斷、分期和預后評估等方面具有重要價值［9］。Nair等［10］研究認為，miRNA的異常表達與細胞生長、凋亡和細胞周期調控等發(fā)生變化有關，并在白血病的發(fā)病機制、病情進展及個體化治療中起到較大的作用。另有研究表明，miRNA通過對蛋白質翻譯過程和mRNA轉錄的影響，參與了ALL的發(fā)生和發(fā)展，對ALL的診斷、病情監(jiān)測和靶向治療具有重要幫助［11］。

本研究顯示，ALL組血清miR-922及miR-506表達水平均明顯高于健康對照組，提示miR-922及miR-506在ALL患兒中異常高表達，其可能通過發(fā)揮癌基因的作用來參與ALL的發(fā)病過程。Rostami等［12］研究顯示，miR-506是一種致癌的miRNA，miR-506的過度表達可導致癌細胞的增加和ALL的發(fā)展，可能為ALL的治療提供新的方向。Ultimo等［13］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在ALL中存在異常表達，miRNA失調與ALL的侵襲及轉移有關，有可能在ALL的發(fā)病機制及治療中發(fā)揮關鍵作用。本研究ROC曲線分析結果顯示，miR-922的截斷值為1.46及miR-506的截斷值為2.17時，miR-922及miR-506診斷兒童ALL的曲線下面積、靈敏度和特異度均較好，說明miR-922及miR-506對兒童ALL診斷具有良好的價值，有望作為診斷兒童ALL的生物學指標。

本研究中有淋巴結腫大、白細胞計數(shù)≥50×109/L、中高危險度分層、MLL基因重排及染色體核型異常的患兒miR-922及miR-506表達水平較高，提示miR-922及miR-506的高表達可能參與ALL的進展過程，在促進ALL發(fā)展中起到一定的作用。Rashed等［14］研究顯示，miRNA的表達失調對ALL的進展及預后有顯著影響，可能是ALL預后判斷的無創(chuàng)性生物標志物。Tapeh等［15］研究認為，miRNA的異常表達對ALL基因調控的機制及其對細胞增殖、轉移、預后和凋亡的影響，將為ALL的靶向治療帶來新的治療策略。本研究分析miR-922及miR-506表達與ALL患兒生存及進展情況的關系，結果顯示miR-922和miR-506高表達組患兒OS率明顯低于miR-922和miR-506低表達組，miR-922和miR-506高表達組患兒PFS率明顯低于miR-922和miR-506低表達組。這說明miR-922及miR-506高表達與ALL患兒的生存期短有關。此外，本研究進一步分析影響ALL患兒預后的相關因素，顯示白細胞計數(shù)≥50×109/L、危險度分層、MLL基因重排、miR-922≥1.46及miR-506≥2.17是導致ALL患兒預后不良的獨立危險因素。王瑞倉等［16］研究也發(fā)現(xiàn)，白細胞計數(shù)、危險程度分層與兒童ALL的發(fā)展及預后有關，可作為ALL患兒預后判斷的參考指標。金芬芬等［17］研究指出，MLL基因重排及白細胞計數(shù)≥50×109/L患兒的預后明顯較差、復發(fā)率較高，與ALL患兒的OS率和PFS率短有關，是影響ALL患兒預后的獨立危險因素，有助于判斷ALL患兒的預后及預測復發(fā)。另有研究表明，miRNA作為一種新的表觀遺傳調控因子，與ALL的發(fā)生、進展密切相關，可作為ALL進展和復發(fā)的生物標志物，為ALL的診斷、治療和預后提供了重要的依據(jù)［18］。

綜上所述，ALL患兒血清miR-922及miR-506表達水平明顯升高，其高表達是ALL患兒預后不良的危險因素，miR-922及miR-506對兒童ALL診斷及預后判斷均具有較好的價值。但本研究尚處于初步探索階段，有關miR-922及miR-506對ALL具體發(fā)病機制、危險分層及其靶向治療的作用仍需更進一步深入研究。