何晨晨，劉俐君，魯曉燕

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】鹽脅迫是植物生長發(fā)育過程中的重要限制因子，MicroRNA(miRNA)在植物應(yīng)答非生物脅迫的過程中具有重要的調(diào)控作用。miRNA是位于基因組非編碼區(qū)的內(nèi)源性的小分子單鏈RNA，長度多為20～24 bp[1]，可特異識(shí)別靶mRNA并與之結(jié)合，降解靶mRNA、抑制翻譯、甲基化，負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)[2]，miRNA可以在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平參與植物體內(nèi)的不同生物學(xué)過程[3]，植物的生長發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對(duì)脅迫的應(yīng)答等[4]。在植物抵御鹽脅迫過程中，miRNA在調(diào)控植物種子萌發(fā)、花芽分化、形態(tài)建成等發(fā)揮重要作用[5]。新疆野蘋果(Malussieversii(Ledeb.)Rome.)屬薔薇科(Rosaceae)，蘋果屬(MalusMill.)植物[6]，新疆野蘋果主要分布在中亞地區(qū)的天山山脈，以及我國新疆西部伊犁和塔城地區(qū)，具有很強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性[7]；新疆野蘋果作為我國西部地區(qū)的蘋果生產(chǎn)的一個(gè)重要砧木，能耐極端最低溫-30℃左右，對(duì)溫度上限不敏感，耐旱力較強(qiáng)，耐瘠薄以及抗病蟲害等多種優(yōu)良的抗逆性狀[8]。尹蓉[9]研究表明，對(duì)15種主要蘋果屬植物的抗逆性相關(guān)生長指標(biāo)及抗逆系數(shù)分析表明，新疆野蘋果屬耐鹽性中等蘋果屬植物資源。于瑋瑋等[10]研究表明，新疆野蘋果幼苗在NaCl脅迫下可通過積累脯氨酸和可溶性糖，提高SOD和POD的活性，以減緩NaCl脅迫對(duì)幼苗造成的傷害且具有一定的耐鹽性?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Xu等[11]利用Illumina測序法對(duì)紅肉甜橙研究顯示，51個(gè)已知的miRNAs在突變型(MT)和野生型(WT)之間有顯著的表達(dá)差異。Pantaleo等[12]在葡萄中鑒定出24個(gè)保守的miRNA家族，26個(gè)已知但不保守的miRNA。王永江等[13]對(duì)甜橙miRNAs進(jìn)行了鑒定，預(yù)測并篩選出其調(diào)控的靶基因與植物與病原物互作相關(guān)。Niu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，梨樹與休眠相關(guān)的MADS-box基因和miRNAs共同控制著梨花芽休眠的轉(zhuǎn)變。Sun等[15]研究表明，柑橘miRNAs及其靶基因與植物的發(fā)育、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)降解等多種細(xì)胞過程有關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】呂新民等[16]預(yù)測miRNA及其靶基因與酸棗生長發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等相關(guān)，其中一些基因可能參與酸棗響應(yīng)NaCl脅迫過程。研究借助先進(jìn)的Illumina測序平臺(tái)對(duì)新疆野蘋果NaCl脅迫應(yīng)答的Small RNA進(jìn)行測序，快速、高效地讀取高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)150 mmol/L NaCl處理6和48 h時(shí)的新疆野蘋果幼苗葉片進(jìn)行small RNA測序。篩選差異表達(dá)的miRNA及其靶基因，為分析新疆野蘋果的耐鹽機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為新疆野蘋果種子，購買于新疆伊犁哈薩克自治州霍城縣61團(tuán)。

新疆野蘋果種子經(jīng)4℃低溫層積處理90 d左右。發(fā)芽后播于進(jìn)口泥炭∶蛭石=3∶1混勻的基質(zhì)中，放置于人工氣候箱(RXZ智能型，寧波江南儀器廠)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度65%～80%，光照強(qiáng)度12 000 lx，發(fā)芽期黑暗狀態(tài)，出苗期光照白天16 h，黑夜8 h。等種子發(fā)芽長出6～8片真葉時(shí)選取生長健壯的幼苗作為試材，剪取約2～3 cm的莖端幼嫩組織接入培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA；繼代增殖培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA，每30 d繼代1次；連續(xù)幾代增殖培養(yǎng)后選取生長健壯的莖段，接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L IBA；所有培養(yǎng)基中均加蔗糖30 g/L、瓊脂粉7 g/L，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值到5.8～6.0。組培苗生根后挑選根系生長較好，長勢健壯且整齊一致的幼苗轉(zhuǎn)入有1/2日本園式營養(yǎng)液水培盒中，培養(yǎng)1周后轉(zhuǎn)入完全營養(yǎng)液中。將水培盒放入人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱外的一側(cè)放置供氧泵，持續(xù)通氧。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

水培苗第6～8片葉完全展開時(shí)，處理：(1)對(duì)照(CK)，日本園式營養(yǎng)液；(2)NaCl處理，日本園式營養(yǎng)液加150 mmol/L NaCl。NaCl濃度以每天50 mmol/L的梯度逐步遞增，全部處理于同1 d達(dá)到目標(biāo)濃度，設(shè)此時(shí)為NaCl處理0 h。分別于處理6和48 h取新疆野蘋果幼苗葉片，樣品用清水沖洗表面雜物，再用去離子水沖洗干凈，用吸水紙吸干表面水分，稱取0.1 g，裝入1.5～2 mL的凍存管中，對(duì)照的葉記作LCK6h、LCK48h；NaCl處理的葉記作LNa6h、LNa48h，迅速投入液氮中冷凍，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 新疆野蘋果sRNA文庫構(gòu)建

提取樣品的總RNA，small RNA測序由南京派森諾基因科技有限公司完成，質(zhì)檢合格后進(jìn)行文庫構(gòu)建。將TotalRNA使用PAGE電泳切膠分離成18～30 nt的RNA，利用Blast將去接頭、去低質(zhì)量、去污染的Clean Reads與Rfam13數(shù)據(jù)庫比對(duì)，統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)庫中小RNA的種類、數(shù)量和類型，并對(duì)其注釋。

1.2.3 NaCl脅迫下miRNAs差異表達(dá)及靶基因GO和KEGG顯著性富集

對(duì)新疆野蘋果葉片差異表達(dá)的靶基因按照分子功能(MolecularFunction)、生物過程(Biological Process)和細(xì)胞組分(CellularComponent)進(jìn)行GO分類，挑選每個(gè)GO分類中挑選p-value最小即富集最顯著的前10個(gè)GOterm條目進(jìn)行展示。

采用DESeq(version1.18.0，Anders S和Huber W，2010)分析4個(gè)處理中表達(dá)差異miRNA，按照表達(dá)量倍數(shù)差異|foldchange|>2和表達(dá)差異顯著性p-value<0.05篩選出差異的保守miRNA。miRNA主要通過互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合到靶位點(diǎn)。以該物種的mRNA的3‘UTR’序列為目標(biāo)序列，對(duì)差異表達(dá)的miRNA序列，使用psRobot_tar進(jìn)行靶基因預(yù)測，并對(duì)靶基因進(jìn)行GO和KEGG顯著性富集分析。

1.2.4 NaCl脅迫下新疆野蘋果葉片差異miRNA與mRNA的反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

miRNA反轉(zhuǎn)錄采用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA kit試劑盒(TIANGE，北京)合成cDNA，qRT-PCR使用miRcute Plus miRNA qPCR Kit試劑盒(TIANGE，北京)，采用20 μL反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL，2×miRcute Plus miRNA PreMix 10 μL，上下游引物(10-M)各0.4l，超純水7.2l。qRT-PCR在CFX96 Real-Time PCR儀(Bio-Rad，美國)上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性15 min，94℃ 20 s，60℃ 34 s，45個(gè)循環(huán)。

mRNA反轉(zhuǎn)錄采用5X All-In-One RT MasterMix試劑盒(abm，加拿大)合成cDNA，qRT-PCR使用Green Real time PCR Master MIX試劑盒(TOYOBO，日本)，采用20 μL反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，超純水7 μL。qRT-PCR在CFX96 Real-Time PCR儀(Bio-Rad，美國)上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1 min，95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。利用Primer 6軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，設(shè)計(jì)好的引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。miRNA內(nèi)參基因?yàn)?srRNA[17],mRNA內(nèi)參基因?yàn)閁BQ[18]?；虻谋磉_(dá)量采用相對(duì)定量的方法，即2-△△CT法[19]。表1

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The sequences of the primers for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆野蘋果葉片不同處理RNA質(zhì)量檢測

研究表明，每個(gè)樣品的RNA完整值(RNA integrity number，RIN)均大于7.5，OD260/280均大于2.0，OD260/230均大于1.6，28S/18S均大于1.5，符合建庫標(biāo)準(zhǔn)。表2

表2 不同處理RNA質(zhì)量檢測Table 2 Quality detection of RNA in different treatments

2.2 新疆野蘋果葉片不同處理small RNA分類注釋

研究表明，測序分別從LCK6h、LCK48h、LNa6h、LNa48h 4個(gè)文庫中獲得35 350 971、34 458 835、43 963 615、35 699 217條Raw Reads，去除污染序列，去除沒有插入片段的reads，去掉包含polyA的序列和小于18 nt的小片段，分別得到29 610 812、28 904 431、41 122 379、33 401 117條Clean Reads，主要包含rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、known miRNA、novelmiRNA、以及unknown片段等。新疆野蘋果葉片LCK6h、LCK48h、LNa6h、LNa48h 4個(gè)處理中Unique Known miRNA數(shù)量分別為6 331、5 561、5 825、6 074，Unique Novel miRNA數(shù)量分別為35、35、37、42。表3

表3 新疆野蘋果數(shù)據(jù)過濾及small RNA分類注釋Table 3 Data filtering and small RNA classification annotation statistics of Malus sieversii

2.3 新疆野蘋果Clean Reads長度分布

研究表明，在LCK6h、LCK48h、LNa6h、LNa48h 4個(gè)處理中Total Reads的長度主要分布在20～24 nt，長度為24 nt的序列所占比例最多，其次是長度為21和20 nt的序列。Unique Reads的長度分布最多的均為24 nt。圖1

2.4 NaCl脅迫下差異miRNA及靶基因預(yù)測

研究表明，在新疆野蘋果已知的miRNA中，與對(duì)照相比，NaCl處理6 h時(shí)的差異miRNA數(shù)量為3個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的為2個(gè)，下調(diào)表達(dá)的為1個(gè)，靶基因數(shù)目為64個(gè)。NaCl處理48 h時(shí)的差異miRNA數(shù)量最多為13個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的為4個(gè)，下調(diào)表達(dá)的為9個(gè)，靶基因數(shù)目為108個(gè)。與NaCl處理6 h相比，NaCl處理48 h時(shí)差異miRNA數(shù)量為5個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的為3個(gè)，下調(diào)表達(dá)的為2個(gè)，靶基因數(shù)目為39個(gè)。NaCl處理6 h和48 h共有的差異miRNA有2個(gè)。表4

2.5 NaCl脅迫下miRNA靶基因GO顯著性富集

研究表明，NaCl處理6 h時(shí)，GO主要富集的分子功能MF主要包括：肌醇磷酸2激酶活性、寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性、寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性等。細(xì)胞組分CC主要包括：網(wǎng)格蛋白復(fù)合物、網(wǎng)格蛋白包被的坑等。生物過程BP主要包括：蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶抑制劑活性、木聚糖代謝過程等。NaCl處理48 h時(shí)，GO主要富集的分子功能MF主要包括：氧氧化還原酶活性、DNA結(jié)合等。細(xì)胞組分CC主要包括：質(zhì)外體、胞外區(qū)等。生物過程BP主要包括：木質(zhì)素代謝過程、苯丙烷分解代謝過程、次生代謝過程等。圖2

注：橫軸為不同的序列長度，縱軸為對(duì)應(yīng)長度的序列豐度(*10 000)。大圖為去重前不同長度的Total Reads分布，右上角小圖為去重后不同長度的Unique Reads分布Note:The horizontal axis is different sequence length,and the vertical axis is the sequence abundance of corresponding length(*10,000).Large image shows total reads of different lengths before deweighting Distribution:The small figure in the upper right corner shows the distribution of Unique Reads with different lengths after deduplication圖1 新疆野蘋果miRNA 長度分布Fig.1 Distribution of miRNA length in Malus sieversii

表4 NaCl脅迫下新疆野蘋果差異表達(dá)miRNA及靶基因Table 4 differential expression of miRNA and target genes in Malus sieversii under NaCl stress

圖2 新疆野蘋果葉片miRNA的差異靶基因Go功能分類Fig.2 Go functional classification of differential target genes of miRNA in Malus sieversii

2.6 NaCl脅迫下miRNA的靶基因KEGG顯著性富集

研究表明，NaCl處理6 h時(shí)，主要富集在N-glycan生物合成、N-磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、光合生物中的碳固定等。NaCl處理48 h時(shí)，主要富集在N-glycan生物合成、其他聚糖降解、煙酸酯和煙酰胺代謝、丙酸酯代謝、真核生物的核糖體生物發(fā)生等通路。NaCl處理6和48 h時(shí)共同富集的是N-glycan生物合成通路。圖3

圖3 新疆野蘋果葉片miRNA的靶基因KEGG通路注釋Fig.3 KEGG pathway annotation of miRNA target gene in Malus sieversii

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA

研究表明，在新疆野蘋果葉片差異顯著的miRNA中選取6個(gè)miRNA和3個(gè)mRNA，mdm-miR168b、mdm-miR159c、mdm-miR827、mdm-miR390f及其靶基因HF10976、mdm-miR171i及其靶基因HF33844、mdm-miR399j及其靶基因HF11095。利用qRT-PCR檢測基因的表達(dá)量，與測序數(shù)據(jù)趨勢基本一致，且miRNA與其靶基因mRNA的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。圖4

圖 4 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 qRT-PCR validation data

3 討 論

miRNA最早于發(fā)現(xiàn)線蟲中[20]，大量miRNA在擬南芥[21]，玉米[22]，番茄[23]，水稻[24]等植物中也相繼被研究發(fā)現(xiàn)。并且各類果樹作物miRNA的研究也日趨成熟，已在蘋果[25-26]、柑橘[27-28]、草莓[29]、葡萄[30-31]、桃[32]等果樹中發(fā)現(xiàn)上百種不同的miRNA。Phillips研究表明，植物miRNA廣泛參與生物脅迫和非生物脅迫等各類逆境脅迫的響應(yīng)[33]，逆境脅迫會(huì)使得植物改變某些 miRNA 的表達(dá)模式，發(fā)生上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，完成對(duì)其靶基因表達(dá)模式的調(diào)控[34]。

葉片中對(duì)照和NaCl處理的Clean reads長度主要分布在20～24 nt，長度為24 nt的序列所占比例最多，這與擬南芥[35]、番茄[36]、藏紅花[37]等研究結(jié)果一樣。對(duì)差異靶基因進(jìn)行分類注釋，NaCl處理6和48 h時(shí)，KEGG共同富集的通路有N-glycan生物合成，天冬酰胺連接的糖鏈(N-linked glycan,N-glycan)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)信號(hào)，劉傳發(fā)[38]對(duì)擬南芥的分析發(fā)現(xiàn)，高爾基體糖原剪切酶突變體MNS1/2催化的N-glycan剪切的缺失調(diào)控了底物蛋白N-糖基化蛋白R(shí)SW2的豐度從而影響了纖維素的合成，產(chǎn)生了鹽敏感的表型，MNS1/2介導(dǎo)的N-glycan的剪切可能調(diào)節(jié)底物蛋白對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。

馮克偉[39]對(duì)耐鹽性野生二粒小麥研究表明，在150 mM鹽脅迫下，7個(gè)miRNAs在3和6 h時(shí)表達(dá)量降低，12和24 h表達(dá)量顯著上升，而在250 mM鹽處理下miRNA在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)均受鹽脅迫抑制了表達(dá)。鹽脅迫下山楊(Populustremula)miR398在3～4 h內(nèi)其表達(dá)受到誘導(dǎo)，在48 h后開始下降，至72 h又開始積累[40]，Chen等[41]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下擬南芥中miR159、miR171等表達(dá)上調(diào)，而miR398的表達(dá)下調(diào)。Liu等[42]在擬南芥中鑒定到在鹽脅迫下miR396、mi R168和miR169等表達(dá)量升高，過表達(dá)miR397的擬南芥植株抗鹽性提高。Patade等[43]發(fā)現(xiàn)甘蔗受到短暫的鹽脅迫后miR159含量顯著提高，miR159在甘蔗抗鹽脅迫過程中發(fā)揮重要作用。Ding等[44]發(fā)現(xiàn)，玉米鹽處理后mi R159大量增加。Wu等[45]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下桑樹(Morusalba)與對(duì)照相比miR827和miR2111的表達(dá)則顯著下降。Sun等[46]研究大豆根尖分生組織發(fā)現(xiàn)miR390e、miR399a、參與了大豆根系耐鹽性的調(diào)控。miR171是最早發(fā)現(xiàn)的 miRNAs 家族成員之一。Fan等[47]研究表明，水稻miR171通過剪切GRAS家族基因OsHAM促進(jìn)營養(yǎng)生長向生殖生長過渡以及根尖分生組織穩(wěn)態(tài)形成；擬南芥miR171通過靶向GRAS家族基因Scarecrow-Like(SCL)調(diào)控?cái)M南芥的葉綠素生物合成[48]。Curaba等[49]發(fā)現(xiàn)大麥過表達(dá)的miR171能夠激活miR156對(duì)其下游靶基因表達(dá)抑制，導(dǎo)致植物營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變。實(shí)驗(yàn)通過microRNA測序及qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，mdm-miR168b、mdm-miR159c、mdm-miR827、mdm-miR390f、mdm-miR171i、mdm-miR399j基因在NaCl處理6和48 h時(shí)表達(dá)量存在差異，其中mdm-miR390f及其靶基因HF10976、mdm-miR171i及其靶基因HF33844、mdm-miR399j及其靶基因HF11095表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，這3個(gè)miRNA參與了新疆野蘋果對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)過程，但是新疆野蘋果不同時(shí)間點(diǎn)miRNA差異表達(dá)的調(diào)控原因及miRNA響應(yīng)NaCl脅迫作用方式還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

NaCl處理6 h時(shí)3個(gè)miRNA差異表達(dá)，其中2個(gè)上調(diào)表達(dá)，1個(gè)下調(diào)表達(dá)，miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因數(shù)目為64個(gè)。NaCl處理48 h時(shí)13個(gè)miRNA差異表達(dá)，其中4個(gè)上調(diào)表達(dá)，9個(gè)下調(diào)表達(dá)，miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因數(shù)目為108個(gè)。mdm-miR390f及其靶基因HF10976、mdm-miR171i及其靶基因HF33844、mdm-miR399j及其靶基因HF11095表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，3個(gè)miRNA參與了新疆野蘋果對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)過程。