常 瑞，王 俊，付開赟，廖蘭蘭，丁新華，何 江，郭文超，吐爾遜·阿合買提，任 羽

(1.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆喀什 844006；2.新疆農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳植物保護站，烏魯木齊 830049；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠化綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；4.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】馬鈴薯甲蟲(LeptinotarsadecemlineataSay)是馬鈴薯毀滅性害蟲。持續(xù)化學(xué)防治使馬鈴薯甲蟲對部分擬除蟲菊酯、氨基甲酸酯、有機磷、新煙堿類和微生物殺蟲劑產(chǎn)生了抗性[1]。使用RNAi技術(shù)，喂食馬鈴薯甲蟲涂抹dsRNA的馬鈴薯葉片，可有效降低、沉默馬鈴薯甲蟲特定基因表達，抑制馬鈴薯甲蟲的正常生長發(fā)育，具有高度專一性、安全性強，且植物生長發(fā)育不受影響，對挖掘更多生物防治策略具有重要意義[2]。但dsRNA生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量無法預(yù)測、穩(wěn)定性低。【前人研究進展】dsRNA在環(huán)境中極不穩(wěn)定，自然條件下3～5 h就會完全降解；San等[3]發(fā)現(xiàn)dsRNA在紫外線照射下，4 h就會完全降解。并且其作用機制研究不系統(tǒng)，植物是否會傳遞、擴增dsRNA以及有害生物對RNAi敏感性差別大等因素[4]。目前，dsRNA主要通過3個方法大量生產(chǎn)：一是合成含有T7啟動子的dsRNA特異性引物，運用體外合成試劑盒合成dsRNA[5,6]。二是原核生物發(fā)酵生產(chǎn)dsRNA，最早用于干擾秀麗引線蟲,喂食秀麗引線蟲時可產(chǎn)生強烈干擾。將構(gòu)建完成的dsRNA表達載體導(dǎo)入RNase III缺陷型大腸桿菌HT115(DE3)感受態(tài)中，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，產(chǎn)生dsRNA[7,8]。三是通過轉(zhuǎn)基因植物表達dsRNA，使植物具有“終生”防御性，害蟲啃食植物后，可有效抑制其生長發(fā)育甚至直接死亡，無需人為干預(yù)[9,10]?！颈狙芯壳腥朦c】方法可大量合成dsRNA，快速高效，合成dsRNA可直接使用，但體外合成試劑盒成本較高，實際大規(guī)模推廣使用不切實際。方法可發(fā)酵得到大量dsRNA，且成本較低。但在發(fā)酵、誘導(dǎo)過程中，如何保證菌體高活性、持續(xù)產(chǎn)生dsRNA，仍需有待研究。針對RNAi的特異性以及原核發(fā)酵獲得dsRNA良好的應(yīng)用前景，以pET-2p和L4440為載體發(fā)酵產(chǎn)生dsRNA的實驗方法為基礎(chǔ)。研究篩選并試驗4種提取菌液總RNA方法以提高菌液dsRNA的獲取率?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用720 bp綠色熒光蛋白gfp[11-13]為模板，分別隨機改變堿基改變GC含量，并構(gòu)建5組不同長度組合的dsgfp片段：201 bp長度的30%CG 含量的dsgfp(簡稱201-30CG，下同)、201-50CG、423-30CG、423-50CG、423-70CG。運用試劑盒體外合成以上5種dsgfp，檢測其濃度、純度作為參照標準。將以上10組表達載體原核發(fā)酵后，運用Trizol法、酚氯仿法、RNA-easy提取液、以及75%酒精沉淀法分別提取dsgfp。建立菌液表達dsRNA的最佳提取方法以及最優(yōu)表達載體提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 載體

pET-2p、L4440質(zhì)粒實驗室保存。

1.1.2 菌株

大腸桿菌HT115(DE3)菌株購自上海唯地生物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)至二代菌株由該實驗室保存。

1.1.3 主要試劑及儀器

試劑：Trans-T1感受態(tài)細胞、2xEasyTaqPCR Super Mix(全式金)；瓊脂糖(西班牙)；LB broth(MDBio，Inc)；卡那霉素(Kana)、四環(huán)素(Tet)、氨芐青霉素(Amp)、IPTG粉末；苯酚∶氯仿混合液(25∶24)等(Solarbio)；質(zhì)粒小抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(OMEGA);HiScribeTMT7High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)；限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI、Hinglll、XhoI(Thermo)；ClonExpressII One Step Cloning Kit、RNA-easy提取液(Vazyme)；Trizol Reagent(ambion)；焦炭酸二乙酯(DEPC，biosharp)；異丙醇、無水乙醇均為分析純；Dnase-/Rnase-free離心管、移液器槍頭(Biologix)。

儀器：離心機(湘立TGL16M)；PCR儀(ICycling 96梯度)；搖床(TASITEDY-200B)；電熱恒溫干燥箱(TASITE202-1AB)；水浴鍋(BATHS)；核酸電泳系統(tǒng)(北京六一 DYY-6D)；凝膠成像系統(tǒng)(Wealtec Dolphin1D)；B-500 BIOPHOTO METER(METASH)；-80℃冰箱(Thermo ULTS1368)；超凈工作臺(江蘇通凈 VD-650)；超純水機(青島富勒姆 FBZ0502-SUP)。

1.2 方 法

1.2.1dsgfp基因、引物合成

以來自于720 bpgfp的序列為模板，對其基因進行設(shè)計優(yōu)化，隨意改變堿基CG含量，交由南京金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成。人工合成了5組不同長度組合的dsgfp片段：201 bp長度的30%CG 含量的dsgfp(簡稱201-30CG，下同)、201-50CG、423-30CG、423-50CG、423-70CG。以T7啟動子為起始序列設(shè)計、合成引物，用于體外合成dsgfp。以XhoI、HindIII(L4440)和KpnI、NotI(pET-2p)為雙酶切位點設(shè)計、合成引物，用于構(gòu)建L4440-gfp和pET-2p-gfp表達載體。表1，圖1

圖1 不同長度、CG組合的dsgfp片段序列Fig.1 Sequence of dsgfp fragments of different lengths and CG combinations

1.2.2 重組表達載體構(gòu)建

1.2.2.1 感受態(tài)細胞制備

HT115(DE3)二代甘油超低溫保存菌種以1∶1 000接種于含四環(huán)素(Tet+)液體LB培養(yǎng)基中，37℃ 250 g離心力培養(yǎng)過夜。挑取單克隆37℃ 250 g離心力培養(yǎng)5 h?；罨缶?∶100在LB液體培養(yǎng)基(Tet+)37℃ 250 g離心力培養(yǎng)2～3 h，至OD為0.4～0.6。將菌液冰上放置10 min，使溫度降至0℃，0.1 mol/L CaCl2溶液同時放置冰上預(yù)冷。4℃ 4 000 g離心力10 min。沉淀中加入5∶1體積預(yù)冷后0.1 mol/L CaCl2溶液懸浮。冰上放置15～30 min，4℃ 4 000 g離心力10 min。沉淀加入25∶1體積0.1 mol/L CaCl2溶液和25∶1體積30%甘油，冰上放置10 min。菌體重懸，分裝并-80℃保存。

1.2.2.2 目的基因PCR擴增及回收

以人工合成的目的片段為模板，使用表1引物進行L4440-gfp、pET-2p-gfp目的片段PCR反應(yīng)：94℃ 3 min；94℃ 30s、61℃ 30s，每個循環(huán)降0.5℃、72℃ 30s，10個循環(huán)；94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s，35個循環(huán)；72℃10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶運用試劑盒回收。

1.2.2.3 L4440-gfp與pET-2P-gfp表達載體的構(gòu)建(1) L4440載體與pET-2p載體線性化

L4440載體雙酶切體系為：6 μL DNA、2 μL XhoI、2 μL HindIII、2 μL 10xFastDigest Green Buffer、8 μL dd H2O，總體積為20 μL，37℃ 15 min；80℃ 10 min。pET-2p載體雙酶切的體系為：6 μL DNA、2 μLNotI、2 μLKpnI、2 μL 10xFastDigest Green Buffer、8 μL dd H2O，總體積為20 μL，37℃15 min；80℃ 5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的DNA。

(2) L4440-gfp與pET-2p-gfp重組載體構(gòu)建與表達

使用ClonExpressII One Step Cloning Kit將線性化質(zhì)粒與目的片段重組，反應(yīng)體系為：10 μL重組產(chǎn)物加入100 μL Trans-T1感受態(tài)，涂布至固體LB培養(yǎng)基(L4440:氨芐青霉素Amp+、pET-2p:卡那霉素KaNa+)37℃倒置過夜。次日挑取單克隆37℃ 250 g離心力培養(yǎng)5 h。運用表1的引物進行菌液PCR驗證。驗證正確的菌液1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基中(L4440:Amp+、pET-2p:KaNa+)37℃ 250 g離心力培養(yǎng)3.5 h，提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，剩余菌液送北京華大基因公司測序。

將驗證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HT115(DE3)感受態(tài)，涂布至LB固體培養(yǎng)基上(L4440:Amp+、pET-2p:KaNa+)37℃倒置過夜。次日挑取單克隆37℃ 250 g離心力培養(yǎng)5 h。運用表1引物進行菌液PCR驗證，保存驗證成功的菌液。

1.2.3 dsgfp的誘導(dǎo)表達

將驗證正確的菌液1∶1 000接種于LB液體培養(yǎng)基(L4440:Amp+、Tet；pET-2p:KaNa+、Tet+)37℃ 250 g離心力活化過夜。以1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基(L4440:Amp+、Tet+；pET-2p:KaNa+、Tet+)37℃ 250 g離心力培養(yǎng)3.5 h，加入IPTG溶液繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5 h。取1 mL菌液提取總核酸，1%瓊脂糖電泳檢測，Image J軟件灰度分析電泳條帶。將成功誘導(dǎo)dsgfp的菌液加50%甘油(1∶1)-80℃保存。

1.2.4 體外合成dsgfp

1.2.4.1 DNA模板制備

將成功誘導(dǎo)dsgfp的菌液1∶1 000接種于LB液體培養(yǎng)基(L4440:Amp+、Tet+；pET-2p:KaNa+、Tet+)37℃ 250 g離心力培養(yǎng)12～16 h提取質(zhì)粒。運用含有T7啟動子目的引物進行PCR反應(yīng)，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶運用試劑盒回收。表1

1.2.4.2 體外轉(zhuǎn)錄、退火形成dsgfp

反應(yīng)體系為：NTP Buffer Mix 10μL，Template DNA 8 μL(0.5 μg)，T7 RNA polymerase Mix 2 μL，總體積為20 μL。37℃溫浴4～6 h。將反應(yīng)液于70℃水浴10 min，冷卻至室溫。加入10∶1體積Dnase I和Rnase A稀釋液(稀釋200倍)，37℃ 30 min。取1 μL合成dsgfp溶于10 μL Nuclease-Free water，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物-80℃保存。

1.2.5 4種方法分別提取l4440-gfp和pET-2p-gfp表達dsgfp

1.2.5.1 Trizol法

取50 mL誘導(dǎo)菌液，4℃ 7 500 g離心5 min。沉淀加入50∶1體積 Trizol，震蕩，室溫放置5 min。加入5∶1體積氯仿，震蕩15s，室溫放置10 min，4℃ 12 000 g離心15 min。上清加入2∶1體積異丙醇，顛倒5～6次，室溫靜置10 min，4℃ 12 000 g離心力10 min。沉淀加入1∶1體積75%乙醇4℃ 7 500 g離心力5 min。重復(fù)洗滌1次。沉淀室溫靜置5～10 min后加入30 μL DEPC水。溶解的dsRNA加入10∶1體積稀釋的Rnase A和Dnase I消化后，37℃ 15 min，-80℃保存。

1.2.5.2 酚氯仿法

取50 mL誘導(dǎo)菌液，4℃ 7 500 g離心力5 min。沉淀加入100∶1 體積STE buffer，渦旋振蕩。加入1∶1體積苯酚：氯仿混合液(25∶24)，渦旋100s。4℃ 15 000 g離心力15 min，上清加入2∶1體積異丙醇，室溫靜置10 min，4℃ 12 000 g離心力10 min。沉淀加入1∶1體積 75%乙醇4℃ 7 500 g離心力5 min。重復(fù)洗滌1次。沉淀室溫靜置5～10 min后加入30 μL DEPC水。溶解的dsRNA加入10∶1體積稀釋的Rnase A和Dnase I消化后，37℃ 15 min，-80℃保存。

1.2.5.3 RNA-easy提取液

取50 mL誘導(dǎo)的菌液，4℃ 7 500 g離心力5 min，1xPBS清洗沉淀。加入100∶1體積 RNA-easy提取液，室溫12 000 g離心力15 min。上清加入1∶1體積異丙醇，室溫靜置10 min。室溫12 000 g離心力10 min。沉淀加入1∶1體積 75%乙醇4℃ 7 500 g離心力5 min。重復(fù)洗滌1次。沉淀室溫靜置5～10 min后加入30 μL DEPC水。溶解的dsRNA加入10∶1體積稀釋的Rnase A和Dnase I消化后，37℃ 15 min，-80℃保存。

1.2.5.4 75%酒精沉淀法

取50 mL誘導(dǎo)菌液，4℃ 7 500 g離心力5 min，沉淀加入25∶1體積 75%乙醇，室溫靜置5 min。加入4∶1體積150 mmol/L NaCl溶液，室溫靜置60 min，4℃ 12 000 g離心力10 min。上清加入10∶1體積稀釋的Rnase A和Dnase I消化后，37℃ 15 min，-80℃保存。

1.2.6 dsgfp濃度、純度測定

1.2.6.1 體外合成dsgfp濃度、純度

取2 μL dsgfp樣品于B-500 BIOPHOTO METER檢測，用Nuclease-Free water分別稀釋至濃度為1 000、500、250、125、62.5和31.25 ng/μL并檢測A260/A280、A260/A230。稀釋dsgfp 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測120 V 25 min。

1.2.6.2 菌液提取dsgfp濃度、純度

取2 μL dsgfp樣本于B-500 BIOPHOTO METER檢測，用Nuclease-Free water分別稀釋至濃度為1 000、500、250、125、62.5和31.25 ng/μL并檢測A260/A280、A260/A230。稀釋dsgfp 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測120 V 25 min。

1.2.7 損失率檢測及dsgfp產(chǎn)量

將體外合成的5組dsgfp分別稀釋至1 000 ng/μL，將30 μL稀釋液混合至50 mL未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)菌液中，運用以上4種方法進行提取，B-500 BIOPHOTO METER檢測濃度、A260/A280和A260/A280。運用最佳提取方法分別提取1 mL菌液dsgfp測定濃度，根據(jù)提取方法損失率，計算pET-2P、L4440表達的dsgfp產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Image J軟件分析載體表達dsgfp灰度值。Microsoft office Excel 2010、SPSS 25.0軟件對體外合成dsgfp以及菌液提取dsgfpA260/A280、A260/A230值進行多重方差分析和新復(fù)極差法進行顯著性分析。2樣本間均數(shù)比較采用配對T檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 IPTG誘導(dǎo)基于PET-2P、L4440產(chǎn)生dsgfp

pET-2p和L4440經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達產(chǎn)生dsRNA，經(jīng)RNase A消化后1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，pET-2p-gfp和L4440-gfp表達載體。圖2

2.2 pET-2P、L4440產(chǎn)生dsgfp電泳條帶

研究表明，基于pET-2P載體表達的5組不同長度、不同CG含量的dsgfp灰度值均高于基于L4440載體表達的5組不同長度、不同CG含量的dsgfp灰度值，具有顯著差異(P<0.05)。其中pET-2p表達201-30CG以及423-30CG灰度值明顯高于L4440表達201-30CG和423-30CG灰度值。圖3

注：a：基于pET-2p表達dsgfp；b：基于L4440表達dsgfp。D2000:分子質(zhì)量標記(天根)，其大小分別是2 000、1 000、750、500、250、100；DL5000：分子質(zhì)量標記(TaKaRa)，其大小分別是5 000、3 000、2 000、1 000、750、500、250、100Note:a:express dsgfp based on pET-2p,b:express dsgfp based on L4440.D2000：molecular mass marker(Tiangen)of 2,000,1,000,750,500,250,100;DL5000：molecular mass marker(TaKaRa)of 5,000,3,000,2,000,1,000,750,500,250,100圖2 基于pET-2p和L4440表達dsgfp 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.2 Agarose gel electrophoresis detection based dsgfp 1.5% pET-2p and L4440 expression

2.3 體外合成dsgfp濃度、純度

研究表明，分別梯度稀釋6組濃度，每組dsgfp A260/A280均在1.9～2.2，合成的5組dsgfp純度較高。稀釋至31.25 ng/μL的5組dsgfp稀釋液，A260/A230值均在3.2～5.0，濃度過低，達到儀器檢測最小閾值，出現(xiàn)偏差。其余5組dsgfp稀釋液均在2.2～3.0。5組體外合成dsgfp可以作為標準品，進行后續(xù)實驗。圖4，圖5

注：D2000:分子質(zhì)量標記(天根)，其大小分別是2 000、1 000、750、500、250、100Note:D2000：molecular mass marker(Tiangen)of 2,000,1,000,750,500,250,100圖4 體外合成dsgfp 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.4 Detection dsgfp 1.5% agarose gel electrophoresis

注：a：5組dsgfp稀釋至不同濃度檢測A260/A280；b：5組dsgfp稀釋至不同濃度檢測A260/A230Note:a：five groups dsgfp diluted to different concentrations A260/A280 detection;b：five groups dsgfp diluted to different concentrations A260/A230 detection圖5 體外合成5組dsgfp濃度、純度Fig.5 Analysis of dsgfp concentration and purity of five groups synthesized in vitro

2.4 4種方法提取菌液dsRNA

2.4.1 提取基于pET-2p載體表達dsgfp

研究表明，根據(jù)提取dsgfp核酸檢測值，對A260/A280和A260/A230利用SPSS分別構(gòu)建多重比較模型，模型截距(F=19 202.406,P=0.000)(F=922.24，P=0.000)，提取方法因素(F=28.408，P=0.000)(F=21.833，P=0.000)分別達極顯著水平，濃度因素分別達到顯著水平(F=2.868，P=0.041)和不顯著水平(F=0.297，P=0.909)。新復(fù)極差法顯著性檢驗顯示不同濃度之間差異不顯著。提取純度最高的Trizol法和酚氯仿法(CK為對照)，且這兩者差異不顯著，其次是75%酒精沉淀法，提取純度最低的為RNA-easy提取液。圖6，圖7

2.4.2 提取基于L4440載體表達dsgfp

研究表明，根據(jù)提取dsgfp核酸檢測值，對A260/A280和A260/A230利用SPSS分別構(gòu)建多重比較模型，模型截距(F=15 242.017，P=0.000)(F=734.211，P=0.000)，提取方法因素(F=30.300，P=0.000)(F=24.085，P=0.000)分別達極顯著水平，濃度因素分別達到顯著水平(F=3.453，P=0.021)和不顯著水平(F=0.344，P=0.880)。新復(fù)極差法顯著性檢驗顯示不同濃度之間差異不顯著。提取純度最高的Trizol法和酚氯仿法(CK為對照)，且這兩者差異不顯著，其次是75%酒精沉淀法，提取純度最低的為RNA-easy提取液。圖6，圖7

注:數(shù)據(jù)后附不同字母者表示在0.05水平上差異顯著(鄧肯氏新復(fù)極差法)；CK：體外合成；Tri：Trizol法；Phe：酚氯仿法；Alc：75%酒精沉淀法；RIR：RNA-easy提取液；a：提取pET-2p和L4440表達dsgfp，分別稀釋至不同濃度檢測A260/A280；b：提取pET-2p和L4440表達dsgfp，分別稀釋至不同濃度檢測A260/A230Note:Those with different letters after the data indicate significant differences at the 0.05 level(Duncan's new multiple range method);CK:in vitro synthesis;Tri:Trizol method;Phe:phenol chloroform method;Alc:75% alcohol precipitation method;RIR:RNA-easy extract;a:Extract pET-2p and L4440 to express dsgfp and dilute to different concentrations to detect A260/A280;b:Extract pET-2p and L4440 to express dsgfp and dilute to different concentrations to detect A260/A230圖6 4種方法提取pET-2p和L4440載體表達dsgfp純度Fig.6 Purity analysis of pET-2p and L4440 vector expression extracted by four methods

注：D2000:分子質(zhì)量標記(天根)，其大小分別是2 000、1 000、750、500、250、100；a:酚氯仿法提取基于pET2p表達dsgfp(經(jīng)Dnase I和Rnase A消化，稀釋至500 ng/μL)；b：酚氯仿法提取基于L4440表達dsgfp(經(jīng)Dnase I和Rnase A消化，稀釋至500 ng/μL)；c：Trizol法提取基于pET2p表達dsgfp(經(jīng)Dnase I和Rnase A消化，稀釋至500 ng/μL)；d：Trizol法提取基于L4440表達dsgfp(經(jīng)Dnase I和Rnase A消化，稀釋至500 ng/μL)Note:D2000:Molecular mass marker(Tiangen),its size is 2,000,1,000,750,500,250,100;a:Phenol-chloroform extraction method based on pET2p expression dsgfp(digested with Dnase I and Rnase A,diluted to 500 ng/μL);b:Phenol-chloroform extraction method based on L4440 to express dsgfp(digested with Dnase I and Rnase A,diluted to 500 ng/μL);c:Trizol method extracts dsgfp based on pET2p(digested with Dnase I and Rnase A,diluted to 500 ng/μL);d:Trizol method extracts dsgfp based on L4440(digested with Dnase I and Rnase A,diluted to 500 ng/μL)圖7 酚氯仿法和Trizol法提取50 mL菌液表達dsgfp 1.5%瓊脂糖凝膠電泳Fig.7 Phenol chloroform method and Trizol method to extract 50 mL bacterial solution to express dsgfp 1.5% agarose gel electrophoresis

2.5 4種提取方法損失率

研究表明，4種方法提取后的體外合成dsgfp與提取前的體外合成dsgfp濃度純度存在明顯差異，經(jīng)SPSS軟件分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中酚氯仿法和Trizol法提取的dsgfp濃度、純度最高，與體外合成的差異最小，計算提取損失率分別為21.44%、23.83%，75%酒精沉淀法和RNA-easy提取液提取的dsgfp濃度、純度最低，與體外合成差異最大，計算提取損失率分別為32.3%、37.62%。表2

表2 4種方法提取內(nèi)標混合純dsgfp濃度、純度Table 2 Comparison and analysis of the concentration and purity of the internal standard mixed pure dsgfp extracted by four methods

2.6 基于pET-2P、L4440產(chǎn)生dsgfp產(chǎn)量

研究表明，基于pET-2P載體表達5組不同長度、不同CG含量的dsgfp濃度均高于基于L4440載體表達5組不同長度、不同CG含量的dsgfp濃度，具有顯著差異(P<0.05)?；趐ET-2P和L4440表達載體1 mL誘導(dǎo)菌液可發(fā)酵產(chǎn)生8.7～24.39 μg、7.48～22.47 μg dsgfp。圖8

注：*表示在0.05水平上差異顯著(配對T檢驗)；a:酚氯仿法提取基于pET-2p和L4440表達dsgfp濃度；b：基于pET-2p和L4440表達dsgfp產(chǎn)量Note:* means significant difference at the 0.05 level(paired T test);a：Phenol chloroform extraction method based on pET-2p and L4440 express dsgfp concentration；b：Based on pET-2p and L4440express dsgfp yield圖8 酚氯仿法提取1 mL菌液dsgfp濃度及產(chǎn)量Fig.8 Analysis of the concentration and yield of dsgfp extracted from 1 mL bacterial solution by phenol-chloroform method

3 討 論

鄒曉蕾、Eber以及Tyagi等[14-17]均報道了提取細菌總RNA的方法，主要包括Trizol法，酚氯仿法以及部分市售RNA快速提取試劑盒。其中Trizol法在細菌總RNA提取中使用較為普遍，利用異硫氰酸胍等物質(zhì)迅速裂解細胞，同時抑制核酸酶的活性，保持RNA的完整性，氯仿使RNA溶于水相，從而與蛋白等物質(zhì)相分離，為提取細菌總RNA的首選方法[18]。苯酚-氯仿抽提也是提取細菌總RNA常用方法之一，利用酚反復(fù)抽提使蛋白質(zhì)變性，SDS(十二浣基磺酸鈉)使細胞裂解，加入氯仿分層，獲得含總RNA的水相[19]。市售總RNA提取試劑盒成本較高、使用次數(shù)有限，不適用于大量提取檢測，故未選用進行實驗。研究表明，以體外合成dsgfp為對照CK，通過使用Trizol法和酚氯仿法可高效提取細菌完整總RNA，經(jīng)Rnase A與Dnase I消化后，可得到較為純凈的dsgfp，損失率最低。RNA-easy提取液和75%酒精沉淀法提取效率明顯低于前者，不適用于快速提取細菌總RNA以及dsgfp。與前人的研究結(jié)果基本一致。運用酚氯仿法，分別取1 mL誘導(dǎo)菌液提取pET-2p和L4440表達的dsgfp，檢測核酸濃度，發(fā)現(xiàn)2個載體表達的423-30CG明顯高于其他4組，說明pET-2p和L4440均具有較強的表達能力。通過濃度分析，根據(jù)提取損失率計算1 mL菌液dsgfp產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)基于pET-2p產(chǎn)生的5組dsgfp產(chǎn)量均高于L4440產(chǎn)生的5組dsgfp產(chǎn)量，最高可達24.39 μg/mL，pET-2p可作為dsgfp的相對最優(yōu)表達載體，用于后續(xù)研究。

提取、純化原核表達dsRNA對于真核生物來說，難度更大，尚無成熟方法借鑒[20]，研究采用4種常用提取細菌總RNA的方法，試圖通過提取完整純凈的總RNA，經(jīng)Rnase A、Dnase I消化得到純凈的dsRNA。Trizol法和酚氯仿提取細菌總RNA，經(jīng)Rnase A、Dnase I消化后，稀釋核酸檢測A260/A280、A260/A230，均值分別為1.77、1.83和1.74、2.1，與體外合成dsRNA值差異最小。但1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，稀釋至不同濃度的dsgfp條帶均出現(xiàn)不同程度彌散，無法得到清晰電泳圖，可能存在以下原因：原核誘導(dǎo)表達的dsgfp脆弱，使用有機溶劑以及提取過程中反復(fù)高速離心損傷dsgfp；核酸檢測稀釋時間過長，dsgfp在自然環(huán)境下發(fā)生降解；電泳液含有核酸酶。

4 結(jié) 論

通過酚氯仿法提取2種載體表達dsgfp，檢測發(fā)現(xiàn)隨著目的片段CG含量增加，2種載體表達的dsgfp濃度及其產(chǎn)量均逐漸降低。pET-2p載體表達能力高于L4440載體，pET-2p可作為dsgfp的相對最優(yōu)表達載體。為后續(xù)dsgfp在不同環(huán)境降解程度研究以及降解產(chǎn)物分析提供了技術(shù)支持。