馬 婷，馬靖雯，關麗娜，穆玉明

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟超聲科，烏魯木齊 830054）

急性冠脈閉塞形成的主要原因是血栓栓塞冠狀動脈導致心肌缺血的改變,此時心肌HE 染色未出現(xiàn)心肌灶狀壞死，重者會進一步發(fā)展成為急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)。心肌肌鈣蛋白T(Cardiac Troponin,cTnT)是一種高靈敏、高特異性反映心肌細胞損傷及壞死的血清標志物，cTnT 在AMI發(fā)生4～6 h 內增高，24 h 達峰值，可持續(xù)5 d，但胸痛6 h內診斷靈敏度較低。因此在急性冠脈閉塞期探究新的生物指標，聯(lián)合cTnT檢測，對于更早發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死顯的尤為重要。

血小板(Platelet,PLT)是一種小的無核細胞，活化后與不同類型的白細胞通過P-選擇素糖蛋白配體1與粘附分子P-選擇素相結合，白細胞與PLT 粘附在血管損傷部位形成血小板-白細胞結合物（Platelet Leukocyte Aggregation，PLA），這也是白細胞促進血栓形成和PLT促進炎癥的重要機制[1-2]。

本研究從炎癥角度出發(fā)，應用介入術制備犬急性冠脈閉塞模型，探討犬處于急性冠脈閉塞時PLA的變化特點及應用價值，分析炎癥反應變化與病理表現(xiàn)是否同步，并與cTnT 進行比較，以期更快、更早發(fā)現(xiàn)急性冠脈閉塞。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取10～13 個月齡的健康比格犬15只（均由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供），體重10～15 kg，雌雄不限，術前禁食12 h、禁水6 h，所有比格犬的處置均根據(jù)新疆醫(yī)科大學倫理委員會的相關規(guī)定(動物倫理委員會審批號：IACUC-20170608-01)。

1.2 應用犬靜脈血體外模擬制備混合性血栓抽取比格犬靜脈血，放入枸櫞酸鈉抗凝管中，抽取上層富含PLT的血漿層及中間邊界層，混合注入EP管中，再依次加入腺苷二磷酸、凝血酶、二氯化鈣（CaCl2），形成的血凝塊孵育在恒溫箱，經病理證實為混合性血栓[3]。

1.3 經皮冠狀動脈介入術置入混合性血栓制備犬急性冠脈閉塞模型將犬麻醉后，氣管插管，呼吸機及電除顫儀備用，局部備皮。 實時動態(tài)監(jiān)測心電圖、血壓以及股動脈壓力變化情況；經皮穿刺犬右側股動脈，將體外制備的混合性血栓置入冠狀動脈內，行冠脈造影確認血流是否被阻斷。 冠脈造影顯示：左前降支中遠段部位冠脈完全閉塞，血流被阻斷，TIMI(the Thromboly?sis in Myocardial Infarction)分級為0 級。

1.4 血樣的采集及測定于術前、閉塞時及閉塞后30 min、1 h、2 h 抽取犬靜脈血，于閉塞后2 h、4 h 抽取犬動脈血備用。

1.4.1 cTnT 的測定 將閉塞后2 h、4 h 抽取的犬動脈血（5 mL），注入有肝素涂層的真空試管中，4℃下以4 000 r/min 離心10 min，取上清液，低溫-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ勒杖募√禺愋约♀}蛋白T（cTnT）酶聯(lián)免疫試劑盒使用方法，測定犬血清中cTnT含量。

1.4.2 PLT 活化標志物CD62P 檢測 取100 μL 血樣加入流式管中，設置空白對照管，IgG1-FITC、IgG1-PE 同型對照管，CD61-FITC、CD62P-PE 單標管各一個，以及樣品管?？瞻讓φ展苤胁患涌贵w，同型對照管同時加入20 μL IgG1-FITC、IgG1-PE，在單標中分別加入20 μL CD61-FITC、20 μL CD62P-PE 抗體，在樣品管中同時加入20 μL CD61-FITC、20 μL CD62PPE 抗體，室溫避光孵育15 min；加入2 mL 紅細胞Ly?sis Buffer（1×）溶血素，室溫避光放置10 min，300 g 離心5 min，棄上清；用2 mL PBS 洗滌2 遍，300 g 離心5 min，去上清，加入500 μL PBS 重懸沉淀，上機檢測。設門：通過調節(jié)電壓將空白細胞群置于陰性區(qū)中；再通過單標樣品調節(jié)補償，使樣品分群明顯后，進行待檢測樣品的鑒定。以CD61-FITC 標記PLT，CD62PPE/CD61-FITC雙陽性活化PLT。

1.4.3 PLA、PMA、PNA、PlyA 檢測方法 棄去前2 mL血液，獲取枸櫞酸鈉抗凝全血標本。取血樣入管，設置空白對照管，IgG1-FITC 同型對照管、CD45-Per?CP-CyTM5.5、CD14-APC、CD61-FITC 單標管各1 個?？瞻讓φ展苤胁患涌贵w，同型對照管加入20 μL IgG1-FITC，在單標中分別加入5 μL CD45-PerCPCyTM5.5，20 μL CD14-APC，20 μL CD61-FITC 抗體，在樣品管中同時加入5 μL CD45-PerCP-CyTM5.5，20 μL CD14-APC，20 μL CD61-FITC 抗體，孵育；加入溶血素，避光放置，加入PBS 重懸沉淀，上機檢測。設門同前。通過CD45-PerCP-CyTM5.5 標記所有白細胞，以CD61-FITC 標記PLT，APC-CD14 標記單核細胞。在CD45-PerCP-Cy/SSC 散點圖中，將白細胞分為中性粒細胞、淋巴細胞，CD14-APC/SSC 區(qū)分單核細胞；通過各自細胞群CD61 陽性率分別檢測PLA占總白細胞百分率、PMA 占總單核細胞百分率、PNA占總粒細胞和PLyA 占總淋巴細胞百分率，分別以PLA（%）、PMA（%）、PNA（%）和PLyA（%）表示。

1.5 組織病理染色術后處死實驗犬取其心臟后，用生理鹽水或Krebs-Henseleit緩沖液灌注，清洗后觀察其外形的變化，從冠脈閉塞區(qū)域垂直于長軸將心臟切成厚約10 mm 的心肌片，10%的甲醛固定、石蠟包埋及組織切片后用HE染色。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析,多組間比較應用單因素方差分析,方差齊時采用LSD法進行組間多重比較,方差不齊時采用Dunnett'sT3 法進行組間多重比較，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 混合性血栓的制備與犬急性冠脈閉塞模型的建立前期研究病理結果示此為混合性血栓[3]。冠脈造影顯示：左前降支中遠段部位冠脈完全閉塞，血流被阻斷，TIMI 分級為0 級。將血栓置入冠狀動脈后，心電圖可見胸前導聯(lián)顯著增高，呈ST段弓背形抬高。

2.2 CD62P 陽性率檢測結果流式細胞圖譜（圖1）分析示在CD62P 陽性率的檢測中，閉塞時、閉塞后30 min、1 h、2 h較術前均降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），閉塞后2 h 降低最明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（見表1）。

圖1 活化PLT檢測的流式圖

表1 CD62P陽性率檢測（n=15）

2.3 PLA、PMA、PNA、PlyA 的表達流式細胞圖譜（圖2）分析量示，閉塞時、閉塞后30 min、1 h、2 h 的PLA 較術前均增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；閉塞時、閉塞后30 min、1 h 的PMA 較術前未見明顯增高，差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05），閉塞后2 h較術前增高且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；閉塞后30 min、1 h、2 h 的PNA 較術前均增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；閉塞后2 h增高最明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；閉塞時的PlyA 較術前增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表2、圖3）。

圖3 不同時段PLA、PMA、PNA、PLyA變化趨勢圖

表2 不同時段PLA、PMA、PNA、PLyA檢測（n=60）

圖2 PLA檢測的流式圖

2.4 犬急性冠脈閉塞不同時段血cTnT 的變化比較術前測定犬cTnT 為（0.1±0.1）μg/L，閉塞后2 h 測定犬cTnT 為（0.2±0.4）μg/L，閉塞后4 h 測定犬cTnT為（1.0±0.1）μg/L。

2.5 心肌HE 染色病理結果心肌纖維排列整齊，未見較粗大凝固性收縮帶、心肌灶狀壞死及炎細胞浸潤等（圖4）。

圖4 心肌組織學改變病理圖（×100）

3 討論

本實驗通過犬靜脈血體外制備混合性血栓，將制備的混合性血栓經介入術置入冠狀動脈內，成功制備了犬急性冠脈閉塞模型。

PLT 在維護血管壁的完整性、生理性止血以及某些病理過程如血栓形成、動脈粥樣硬化和炎癥反應等過程中起著重要作用，尤其是在急性冠脈綜合征的發(fā)生發(fā)展中。在AMI 發(fā)生發(fā)展中，血小板的活化起到至關重要的作用，在正常的生理條件下，PLT 以不活躍的形式存在；當在體內外各種因素刺激下PLT發(fā)生變形、粘附、聚集和釋放反應，當血栓阻塞冠脈，形成急性冠脈閉塞時，大量白細胞和PLT在急性缺血心肌中活化[4]，其中血小板α-顆粒膜糖蛋白(CD62P)就是一種血小板活化標志物，能夠提高血小板的粘附能力，有促進血小板形成等功能[5]。本實驗結果示CD62P 陽性率，犬急性冠脈閉塞時、閉塞后30 min、1 h、2 h 較術前均降低，且差異具有統(tǒng)計學意義，隨著實驗進行逐漸降低，于閉塞后2 h 降至最低，這與以往研究結果活化PLT可快速丟失其表面的CD62P[6]相符合。由于CD62P易快速降解且不夠穩(wěn)定，因此PLA較CD62P 相比能更穩(wěn)定保留在外周血中[7]。PLA 又包括PNA、PMA 和PlyA。本實驗CD62P 陽性率于閉塞后2 h 降至最低，PMA 水平于閉塞后2 h 開始明顯增高，與其半衰期較長有關（約為30～60 min），且其為血小板活化的敏感標志物[8-9]。

有研究顯示，與非急性冠狀動脈綜合征患者相比，急性冠狀動脈綜合征患者中PLA、PNA、PMA、PlyA 水平明顯增高[10-12]。中性粒細胞主要通過分泌趨化因子聚集在缺血區(qū)的血管系統(tǒng)中，并分泌多種激素，如補體激活因子、白三烯等細胞因子，從而導致血管收縮及PNA 生成，這與本實驗中犬急性冠脈閉塞時，閉塞后30 min、1 h、2 h 的PNA 較術前均增高相吻合。PNA 刺激中性粒細胞使其活化后，細胞內的染色質DNA 及抗菌顆粒蛋白等釋放到細胞外形成網狀結構，即中性粒細胞胞外誘捕網，最終參與了血栓形成。

cTnT 主要存在于肌原纖維細肌絲中，是肌動蛋白的主要成分，約5%左右存在于胞漿中[13]。在心肌細胞受到可逆性損傷時，胞漿中游離的cTnT 首先釋放入血，導致血清cTnT 短暫性增高。如發(fā)生不可逆性損傷，導致心肌壞死，肌絲上結合池cTnT 釋放[14]，導致血清cTnT 持續(xù)性增高。AMI 患者中cTnT 可顯著增高，且持續(xù)較長時間。結扎犬冠狀動脈左前降支，cTnT 在2 h 后顯著升高，反映了心肌細胞的損傷程度，并且局部炎癥連鎖反應對心肌細胞損傷具有放大作用。本實驗結果表明犬急性冠脈閉塞4 h 后cTnT 開始顯著升高，說明2 h 犬處于急性冠脈閉塞狀態(tài)，且心肌HE 染色病理切片示心肌及心肌纖維排列整齊，未見較粗大凝固性收縮帶、心肌灶狀壞死及炎細胞浸潤。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，犬處于急性冠脈閉塞時，HE染色心肌細胞未出現(xiàn)壞死，與術前比較，PLA 于閉塞時開始增高，cTnT 于閉塞后4 h 開始增高，說明犬處于急性冠脈閉塞時，炎癥反應出現(xiàn)變化要早于心肌細胞的壞死性損傷。