何曉娜，楊曉玲，王宏博，席 斌，王 芳，李維紅，郭天芬，高雅琴,

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050；2.農(nóng)業(yè)部畜產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050）

羊肉富含多種維生素、礦物質(zhì)及人體必需的不飽和脂肪酸（PUFAS）[1]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著國民生活水平的提高及膳食結(jié)構(gòu)的改變，人們對(duì)冷鮮羊肉的需求量不斷上漲。目前，用于羊肉貯藏的溫度控制方式有冷藏、冰溫、微凍和冷凍四種[2]。冷凍過程中肉品產(chǎn)生一系列不良的物理化學(xué)變化導(dǎo)致肉品品質(zhì)較差，且設(shè)備能耗高[3]；冰溫和微凍條件下的肉品品質(zhì)較好，貯藏期限較長(zhǎng)，但現(xiàn)階段冰溫和微凍貯藏設(shè)備較為昂貴且數(shù)量較少，在我國并沒有廣泛應(yīng)用到肉品的貯藏中[4]；我國在保證肉品品質(zhì)的情況下最常用的貯藏方式仍然為4 ℃冷藏。

氧化是導(dǎo)致肉品質(zhì)劣變的一個(gè)重要原因，肉類氧化變質(zhì)主要是由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化及二者之間存在的交互氧化作用引起的[5]。肉中脂質(zhì)的氧化反應(yīng)過程復(fù)雜，其開始于動(dòng)物屠宰之前，宰后隨著環(huán)境的改變和內(nèi)部抗氧化能力的減弱，脂質(zhì)氧化程度進(jìn)一步增強(qiáng)[6]。適度的脂質(zhì)氧化可以使肉品獲得良好的風(fēng)味，但是大多數(shù)情況下會(huì)發(fā)生過度氧化產(chǎn)生不愉悅氣味以及一些有毒物質(zhì)如丙二醛、膽固醇氧化產(chǎn)物等[7]。目前通常用硫代巴比妥酸反應(yīng)物值（TBARS）來反映肉品的脂質(zhì)氧化程度，TBARS 值越大，肉品氧化程度越深[8]。肉品蛋白質(zhì)的氧化會(huì)降低肉的保水性、嫩度、色澤和風(fēng)味特性，肌肉蛋白的氧化會(huì)導(dǎo)致側(cè)鏈氨基酸的氧化修飾，主要包括巰基氧化、芳香族羥基化和羰基的形成[9]。用總巰基的含量來表示蛋白質(zhì)的氧化程度時(shí)，巰基含量越低蛋白質(zhì)氧化變性程度越高[10]。此外，研究表明脂質(zhì)的氧化產(chǎn)物如丙二醛等可與氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合，間接導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化[11]，因此，脂質(zhì)的氧化產(chǎn)物被認(rèn)為是蛋白質(zhì)氧化的促進(jìn)劑[12]。風(fēng)味是影響消費(fèi)者購買肉類習(xí)慣和偏好的重要因素[13]，其受到脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化的影響。目前關(guān)于肉品風(fēng)味的研究主要集中在畜禽品種[14]、性別及年齡等[15]對(duì)其的影響上，關(guān)于貯藏時(shí)間對(duì)生鮮肉風(fēng)味特性影響的研究較少。

本試驗(yàn)以小尾寒羊肉為研究對(duì)象，模擬最接近中國人生活習(xí)慣的貯藏方式，僅采用保鮮膜對(duì)羊肉進(jìn)行包裝，探究4 ℃冷藏期間羊肉蛋白和脂質(zhì)的氧化及風(fēng)味物質(zhì)的變化情況，以期為生鮮羊肉的貯藏提供有價(jià)值的基礎(chǔ)研究參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

同一飼養(yǎng)條件下6 月齡小尾寒羊的背最長(zhǎng)肌500 g 甘肅省民勤縣；普通市售PE 保鮮膜 華潤萬家超市；三氯乙酸 上海麥克林公司；硫代巴比妥酸、總巰基檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶生物公司；2-丁酮（2-butanone）、2-戊酮（2-pentanone）、2-己酮（2-hexanone）、2-庚 酮（2-heptanone）、2-辛 酮（2-octanone）、2-壬酮（2-nonano）等均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

BCD-460WDGZ 型冰箱 海爾股份有限公司；Mixer B-400 型均質(zhì)儀 瑞士Buchi 公司；BSA224S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Vortex-Genie2 渦旋混勻器 美國Scientific Industries 公司；HH-2 型恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SIGMA 3K 離心機(jī) 德國SIGMA 公司；UV-2550 紫外分光光度儀 島津儀器有限公司；FlavourSpec ?型氣相離子遷移譜 德國G.A.S 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 試驗(yàn)羊宰前24 h 禁食禁水，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化屠宰后，將樣品裝入潔凈密封袋中，迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，待肉冷卻之后將肉樣切成30 g 左右的肉塊，使用保鮮膜進(jìn)行分裝編號(hào)后置于4 ℃冷藏室中貯藏，每天取樣均質(zhì)后測(cè)定蛋白和脂質(zhì)氧化程度，1、3、5、7 d 測(cè)定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，直至肉品腐敗變質(zhì)。

1.2.2 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）值的測(cè)定 參考Wang 等[16]的方法并稍作修改，稱取肉樣5 g，加入10 mL 20%（W/V）的三氯乙酸（TCA）溶液，渦旋混勻，隨后于3500 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，過濾上清液。取5 mL 上清液，加入相同體積的0.02 mol/L的硫代巴比妥酸（TBA）溶液，將上述混合液在90 ℃水浴中孵育30～40 min，取出冷卻至室溫后測(cè)定532 nm波長(zhǎng)處的吸光值（A532）。

1.2.3 巰基含量的測(cè)定 使用索萊寶生物公司提供的總巰基含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

1.2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定 取均質(zhì)樣品3.0 g 于頂空瓶中，采用自動(dòng)頂空進(jìn)樣方式，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行。

頂空孵育溫度60 ℃；孵化時(shí)間15 min；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；進(jìn)樣針溫度80 ℃；進(jìn)樣體積500 μL；不分流模式；色譜柱類型為MXT-5（15 m×0.53 mm×1 μm）；柱溫60 ℃；色譜運(yùn)行時(shí)間21 min，初始柱流速2 mL/min，保持2 min，8 min 內(nèi)線性增至100 mL/min 并保持10 min；載氣為高純氮?dú)猓ā?9.999%），漂移氣流量設(shè)為固定流量150 mL/min，IMS 溫度保持45 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次。用Excel 2007 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，sas 9.4 進(jìn)行方差分析，origin 8.5 軟件繪圖。以P<0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析采用儀器自帶的Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件，使用GC-IMS Library Search 軟件內(nèi)置的NIST 和IMS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性分析，Gallery 插件構(gòu)建指紋圖譜，dynamic PCA plug-ins 進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肉冷藏期間TBARS 值的變化情況

脂質(zhì)氧化的主要產(chǎn)物是過氧化物，氧化物在過氧化物酶的作用下進(jìn)一步分解形成醛（丙二醛）、酮、脂肪酸等低分子量產(chǎn)物；形成的丙二醛可與硫代巴比妥酸反應(yīng)形成粉紅色，可用于脂質(zhì)氧化程度的測(cè)量[17]。貯藏過程中硫代巴比妥酸值的增加與脂質(zhì)氧化有關(guān)[18]。通常情況下，人們能感知到的最低酸敗值為1.0 mg/kg[19]。由圖1 可知，羊肉在7 d 冷藏期內(nèi)TBARS 值隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)，發(fā)生了顯著變化（P<0.05），第5 d 時(shí)達(dá)到人們能感知的酸敗程度，TBARS 值為1.085 mg/kg。貯藏前5 d，TBARS 值呈顯著上升趨勢(shì)（P<0.05）；第6 d TBARS 值顯著下降（P<0.05），TBARS 值 為0.826 mg/kg，相比于第5 d 下降了0.26%；貯藏至第7 d 時(shí)TBARS 值相對(duì)于第5 d 約增加了61.2%。黃晶晶等[20]對(duì)豬肉低溫貯藏期間品質(zhì)變化的研究中發(fā)現(xiàn)，冷藏豬肉在貯藏第5 d 時(shí)TBARS 也呈現(xiàn)出了下降趨勢(shì)。Chouliara 等[18]使用牛至油和氣調(diào)包裝處理雞胸肉發(fā)現(xiàn)各組的TBARS 值隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)出先上升后下降或者先上升后下降再上升的趨勢(shì)。李夢(mèng)琪[21]對(duì)歐拉藏羊肉進(jìn)行冷凍貯藏后測(cè)定TBARS 值，顯示在凍藏至60 d 時(shí)，TBARS 值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。分析出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是因?yàn)樵诶洳厍捌谘蛉饨M織結(jié)構(gòu)中含有大量的小孔隙，與空氣的接觸面積較大，從而促進(jìn)了油脂的氧化，冷藏第6 d 時(shí)，TBARS 值開始降低，可能是因?yàn)橹狙趸a(chǎn)物丙二醛與羊肉中蛋白質(zhì)發(fā)生了相互作用，導(dǎo)致丙二醛的產(chǎn)生速率小于與蛋白質(zhì)結(jié)合速率，因此出現(xiàn)了下降的現(xiàn)象。

圖1 不同貯藏時(shí)間羊肉脂質(zhì)氧化程度變化趨勢(shì)Fig.1 Variation trend of lipid oxidation degree of mutton at different storage time

2.2 羊肉冷藏期間巰基值的變化情況

肉品品質(zhì)、加工特性及營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味、滋味受蛋白質(zhì)氧化的影響極大。評(píng)判蛋白質(zhì)氧化的指標(biāo)主要為羰基衍生物的產(chǎn)生量、巰基值的損失及蛋白交聯(lián)物的形成[21?22]，該試驗(yàn)以總巰基值的損失來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的氧化程度。肉類蛋白中半胱氨酸殘基中的硫醇基團(tuán)極易被任何形式的活性氧（ROS）氧化，轉(zhuǎn)化為二硫鍵和其他硫醇氧化產(chǎn)物，如磺酸、亞砜及硫代亞磺酸鹽等[23]。由圖2 可知，在整個(gè)冷藏期間，肌原纖維蛋白總巰基含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。在貯藏期的前4 d 巰基含量呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P<0.05），在第4 d 之后呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)（P<0.05）。冷藏第1 d的巰基含量為1.78 μmol/g，第4 d 時(shí)巰基含量為1.03 μmol/g，巰基含量損失約0.75 μmol/g；第7 d 時(shí)巰基含量為1.45 μmol/g，相比于第4 d 約增加了0.42 μmol/g，相比于第1 d 損失了約0.33 μmol/g。貯藏前期，巰基含量顯著減少可能是由肌球蛋白的降解導(dǎo)致巰基暴露出來被氧化所引起的[24]；第4 d 之后，總巰基含量呈上升趨勢(shì)，這與盧驍?shù)萚25]的研究結(jié)果不一致，分析導(dǎo)致巰基含量增加的原因可能與脂類氧化衍生物含量的降低有關(guān)[26]，其次還可能與活性氧的含量有關(guān)。

圖2 不同貯藏時(shí)間羊肉蛋白質(zhì)氧化程度變化趨勢(shì)Fig.2 Variation trend of protein oxidation degree of mutton at different storage time

2.3 羊肉冷藏期間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化分析

2.3.1 羊肉揮發(fā)性化合物的定性 揮發(fā)性化合物的定性是根據(jù)該物質(zhì)在色譜柱中的離子遷移時(shí)間和保留指數(shù)與儀器內(nèi)置的NIST 和IMS 數(shù)據(jù)庫比對(duì)進(jìn)行鑒別的，部分化合物會(huì)產(chǎn)生二聚體甚至三聚體，它們的保留時(shí)間相近，遷移時(shí)間不同[27]。

表1 列出了整個(gè)冷藏期間所鑒定出的揮發(fā)性化合物組分，包括化合物名稱、CAS 號(hào)、保留指數(shù)、保留時(shí)間和遷移時(shí)間。由表1 可知，從冷藏羊肉中共鑒別出了31 種揮發(fā)性化合物，分別為醇、酯、烴、酮、醛、酚、醚、吡嗪及含硫化合物9 大類，還有5 種化合物未定性出來。在整個(gè)貯藏過程中，羊肉中的揮發(fā)性化合物主要為酮類，其次為醛類和醇類；沒有發(fā)現(xiàn)辛酸、己酸等膻味物質(zhì)。2-庚酮、2-戊酮、3-羥基-2-丁酮、乙醇、叔丁醇、正己醛、3-甲硫基丙醛、苯甲醛出現(xiàn)了二聚體，其在離子遷移光譜圖和指紋圖譜中表現(xiàn)為雙峰。

表1 冷藏羊肉中揮發(fā)性化合物的定性分析Table 1 Qualitative analysis of volatile compounds in refrigerationmutton

冷藏期間未檢測(cè)出烷烴類物質(zhì)。IMS的本質(zhì)是檢測(cè)揮發(fā)性化合物和水合質(zhì)子形成的質(zhì)子化單體，由于樣品的頂空氣體和載氣中含有水蒸氣，導(dǎo)致漂移管電離區(qū)烷烴的電荷很難得到，因此，GC-IMS 光譜在定性檢測(cè)結(jié)果中顯示烷烴很少或者沒有[28]。

2.3.2 不同貯藏時(shí)間羊肉揮發(fā)性成分的指紋圖譜分析 在GC-IMS的指紋圖譜中，特征峰的顏色越深，表明其該物質(zhì)含量越高。由圖3 結(jié)合表可知，不同貯藏時(shí)間樣品的成分之間有較大差異，第7 d 時(shí)揮發(fā)性化合物種類最多。其中乙酸己酯、異丁香酚、愈創(chuàng)木酚在羊肉冷藏期間含量變化不大，這三種物質(zhì)分別具有水果清甜的氣味、柔和清甜的辛香味及一種特殊的芳香氣味。叔丁醇（A 區(qū)域）在貯藏第1 d 含量最高，叔丁醇具有樟腦氣味，其隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。

圖3 不同貯藏時(shí)間冷藏羊肉揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜Fig.3 Fingerprints of volatile substances of refrigeration mutton at different storage times

庚醛、正辛醛、正己醛（B 區(qū)域）在第3 d的含量較高，它們分別具有油脂、青草及水果香味，是構(gòu)成羊肉香味的主要物質(zhì)[29]。醛類物質(zhì)主要來源于原料肉中不飽和脂肪酸的氧化和糖降解，低分子量的醛通常產(chǎn)生難聞的氣味，高分子量的醛具有類似水果味的香甜味，醛類物質(zhì)不穩(wěn)定，很容易與其他化合物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生不同風(fēng)味的化合物[30?31]。

貯藏至第5 d 時(shí)出現(xiàn)3-羥基-2-丁酮和2-庚酮（C 區(qū)域），這兩種化合物呈現(xiàn)出令人愉悅的奶香氣；3-羥基-2-丁酮又名乙偶姻，其是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，可能來源于油酸氧化或者葡萄糖的分解[32]，對(duì)肉品的香味的形成起著非常重要的作用[33]。Casaburi等[34?35]報(bào)告稱肉樣品中出現(xiàn)具有乳脂味，奶酪味的相關(guān)酮類物質(zhì)可以歸因于微生物密度和多樣性的增加，因此，這兩種化合物的出現(xiàn)可能是微生物的作用引起的。

二甲基二硫、2-甲基丁醇、異丁醛、異戊醛以及未定性出的化合物2、3（D 區(qū)域）均僅出現(xiàn)在第7 d，其中二甲基二硫是一種有惡臭味的物質(zhì)；異丁醛具有強(qiáng)烈的刺激性氣味；異戊醛具有酸敗味，有強(qiáng)烈的令人惡心的氣息可能與羊肉的膻味有關(guān)[36]。

2.3.3 主成分分析 根據(jù)不同貯藏時(shí)間羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的離子遷移指紋圖譜，采用儀器自帶Dynamic PCA plug-ins 軟件進(jìn)行主成分分析處理。結(jié)果如圖4 所示，第一主成分的貢獻(xiàn)率為79%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為10%，第三主成分的貢獻(xiàn)率為5%，三個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率超過90%，分析所得數(shù)據(jù)能夠反映不同貯藏時(shí)間羊肉揮發(fā)性成分變化的總體特征。四個(gè)貯藏時(shí)間點(diǎn)的樣品分布在不同的區(qū)域，且各個(gè)點(diǎn)比較集中，表明不同貯藏時(shí)間揮發(fā)性物質(zhì)存在明顯差異。主成分分析結(jié)果表明，氣相離子遷移譜能夠根據(jù)風(fēng)味物質(zhì)的變化情況判別和區(qū)分不同貯藏時(shí)間的羊肉。

圖4 不同貯藏時(shí)間羊肉PCA 分析圖Fig.4 PCA analysis of mutton at different storage times

3 討論與結(jié)論

本研究利用化學(xué)方法分析了羊肉冷藏期間蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化情況，結(jié)果表明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化程度逐步加深，并發(fā)現(xiàn)第5 d 是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，證明了脂質(zhì)的氧化程度和蛋白質(zhì)的氧化呈現(xiàn)出相關(guān)性。利用GC-IMS 技術(shù)分析了冷藏期間羊肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，冷藏期間共檢測(cè)出39 種化合物，鑒別出31 種。其中第1 d 揮發(fā)性物質(zhì)的種類較少，庚醛、正辛醛、正己醛等羊肉的主要香味物質(zhì)第3 d 時(shí)含量最高，第5 d 出現(xiàn)了由微生物數(shù)量增多引起的3-羥基-2-丁酮和2-庚酮，第7 d 揮發(fā)性物質(zhì)種類最多，出現(xiàn)了導(dǎo)致羊肉酸敗腐臭的二甲基二硫和和異丁醛等物質(zhì)；且以上特征揮發(fā)性化合物的出現(xiàn)與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化也呈現(xiàn)出相關(guān)性。參考前人的研究思路[37?38]，進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，證明PCA 能基于揮發(fā)性成分的變化對(duì)不同貯藏時(shí)間的羊肉進(jìn)行有效區(qū)分。

后續(xù)的研究有必要縮短檢測(cè)時(shí)間段，找出肉品品質(zhì)最佳的時(shí)間點(diǎn)，以及對(duì)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化的具體機(jī)理進(jìn)行探究；除此之外，需要進(jìn)一步完善IMS 數(shù)據(jù)庫，擴(kuò)展GC-IMS 分析技術(shù)在肉品風(fēng)味領(lǐng)域的研究。