徐佳,黃雪芹,楊建飛,易媛,馬倩,胡琨,左勇,*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院,四川 宜賓,644000) 2(四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都,610000)

桑葚酒是一種以桑葚汁為原料經(jīng)酵母發(fā)酵而成的果酒[1],含有豐富的花青素,具有補(bǔ)血、明目等功效[2],已成為繼葡萄酒之后的第二大類果酒[3]。高級醇作為果酒風(fēng)味物質(zhì)的骨架成分,在桑葚酒中不僅能夠起到呈香呈味的作用,還是構(gòu)成酯類的前體物質(zhì),但含量過高,則會導(dǎo)致酒中產(chǎn)生異雜味,飲后還會造成口渴、頭痛等現(xiàn)象[4]。果酒中高級醇含量超過400 mg/L時(shí),會明顯加重酒中的辛辣刺激感[5],而目前我國市售的桑葚酒中,高級醇含量大都在400 mg/L以上[6],因此嚴(yán)格控制桑葚酒中的高級醇含量對提高桑葚酒品質(zhì)具有重要意義。

高級醇作為桑葚酒釀造過程中釀酒酵母產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,其中含量最高的是異丁醇和異戊醇,主要由:支鏈氨基酸分解途徑(Ehrlich途徑)[7]和糖代謝合成途徑(Harrsi途徑)[8]產(chǎn)生。果酒中有25%的高級醇來自Ehrlich途徑,在此途徑中由BAT2基因編碼的細(xì)胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶是第一步關(guān)鍵酶[9]。LI等[10]通過敲除BAT2基因,降低了白酒中28.85%的高級醇含量;ZHANG等[11]通過敲除BAT2基因,使黃酒中異丁醇和異戊醇分別降低了33%和14.2%。但目前國內(nèi)針對降低桑葚酒中高級醇含量的研究仍集中在工藝條件的優(yōu)化[12]和外源添加物的選擇[13]等方面,采用基因工程的手段,從分子水平改造酵母降低桑葚酒中高級醇的研究尚屬空白,對二倍體酵母中的等位基因進(jìn)行單、雙缺失來逐步降低桑葚酒中高級醇的研究更為少見。

本文以實(shí)驗(yàn)室前期從桑葚自然發(fā)酵液中選育的優(yōu)良二倍體釀酒酵母S3為出發(fā)菌株,分別敲除1個BAT2等位基因和2個BAT2等位基因后,對敲除菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),研究BAT2基因缺失對桑葚酒發(fā)酵過程中高級醇生成量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)中所用菌株和質(zhì)粒如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids in this study

續(xù)表1

1.1.2 引物

根據(jù)NCBI公布的釀酒酵母S.cerevisiaeS288c 的BAT2基因序列,設(shè)計(jì)PCR引物,如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)中所用引物Table 2 Primers used in this study

1.1.3 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Taq聚合酶、Pfu酶、T4 DNA連接酶,近岸蛋白質(zhì)科技有限公司;遺傳霉素(G418)和博來霉素(Zeocin),北京索萊寶科技有限公司;酵母基因組 DNA 提取試劑盒、純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒,北京艾德萊生物科技有限公司;引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成；標(biāo)準(zhǔn)品正丙醇、異戊醇、異丁醇、2-苯乙醇(純度均>99.5%,GC),上海麥克林生化有限公司。

PCR 基因擴(kuò)增儀(5020),賽默飛世爾科技(中國)有限公司;臺式高速離心機(jī)(D3024),大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司;電泳儀(DYY-8C),北京六一生物科技有限公司;氣質(zhì)聯(lián)用儀(6890 N-5975B),美國Agilent公司;恒溫恒濕箱(GZ-250-HS11),韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司;恒溫水浴鍋(HWS-12),上海喬欣科學(xué)儀器有限公司;凝膠成像系統(tǒng)(Gel DocTMXR+),伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.1.4 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基,YEPD培養(yǎng)基,半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (將YEPD 培養(yǎng)基中葡萄糖改為半乳糖即可)[14]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過1.1.2中的引物,以原始菌株S3的基因組為模板擴(kuò)增BAT2基因的上下同源臂片段BA、BB和BAT2基因中的部分片段BA1、BB1,再以 pUG6質(zhì)粒為模板擴(kuò)增KanMX片段。然后以酶切連接法依次連接到質(zhì)粒 pUC19 上獲得重組質(zhì)粒。

1.2.2 酵母轉(zhuǎn)化

將擴(kuò)增片段利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[15]轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母S3,涂布于含500 μg/mL G418的YEPD抗性平板,30 ℃培養(yǎng)48 h后,對平板上生長的單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.3KanMX抗性基因的去除

為敲除BAT2兩個等位基因,需反復(fù)利用KanMX抗性基因作為篩選標(biāo)記。采用Cre/loxP系統(tǒng),去除陽性轉(zhuǎn)化子中的KanMX篩選標(biāo)記基因:先將pSH65質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入陽性子后接入半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)4～5 h,再利用影印平板法篩選 G418 抗性陰性轉(zhuǎn)化子,最后進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.4 pSH65質(zhì)粒的丟失

pSH65質(zhì)粒中的Cre重組酶發(fā)揮作用后,需將其從菌株中移除,以防止其中的Cre重組酶會在后續(xù)的敲除試驗(yàn)中提前表達(dá)。將帶有pSH65質(zhì)粒的目的菌株,接入10 mL無抗YEPD液體培養(yǎng)基中,傳至8～10代,PCR驗(yàn)證是否丟失質(zhì)粒。

1.2.5 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

取斜面菌種一環(huán)接種到滅菌后的20 mL桑葚果汁中,25 ℃,180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h后,以10%接種量轉(zhuǎn)接到200 mL桑葚果汁中,25 ℃,180 r/min 振蕩培養(yǎng)18～24 h。再以5%的接種量接入調(diào)整好成分后的200 mL桑葚果汁中,25 ℃恒溫?zé)o氧發(fā)酵5 d。

1.3 分析方法

1.3.1 生長曲線

取斜面菌種1環(huán),接到10 mL YEPD液體培養(yǎng)基中,30 ℃,180 r/min 培養(yǎng)12 h。再以1% 接種量轉(zhuǎn)接至200 mL YEPD液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每隔2 h測定600 nm處的吸光值。

1.3.2 理化測定

CO2失重:按照文獻(xiàn)[16]描述的方法每隔12 h稱重1次;酒精度:采用比色法[17];還原糖:采用斐林試劑法;總酸:參照GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法，采用電位滴定法。

1.3.3 高級醇的測定

1.3.3.1 氣相色譜的條件

采用外標(biāo)法根據(jù)各組分峰面積定量計(jì)算各組分含量。色譜條件參照文獻(xiàn)[13]調(diào)整為:毛細(xì)管柱J&W 122-7062 DB-WAX(60 mm×0.25 mm,0.25 μm);柱溫40 ℃保持3 min,然后以4 ℃/min升至77 ℃,保留1 min,以4 ℃/min升至97 ℃,保留1 min,以4 ℃/min升至107 ℃,保留1 min,以6 ℃/min升至132 ℃,保留1 min,以15 ℃/min升溫至230 ℃,保持5 min;進(jìn)樣器溫度230 ℃;檢測器溫度230 ℃,無分流進(jìn)樣;載氣He,恒流1.0 mL/min。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

根據(jù)文獻(xiàn)[18]中的方法進(jìn)行調(diào)整,準(zhǔn)確量取異戊醇0.5 mL、異丁醇0.2 mL、正丙醇和苯乙醇各0.1 mL于100 mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇溶液(色譜級無水乙醇與超純水配制)定容,得到混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

再分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶,用體積分?jǐn)?shù)12%乙醇溶液定容,配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液待進(jìn)樣,根據(jù)各物質(zhì)峰面積,對質(zhì)量濃度進(jìn)行一元線性回歸分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.3 樣品前處理

取50 mL桑葚酒樣品與50 mL蒸餾水于250 mL蒸餾瓶中蒸餾,得到45 mL蒸餾液后,以蒸餾水定容至50 mL,為待測樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌株S3-1的構(gòu)建

2.1.1 構(gòu)建獲得敲除質(zhì)粒pUC-BAKB

按酶切連接法構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-BAKB,其流程及結(jié)果見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pUC-BAKB的構(gòu)建流程圖Fig.1 Flow chart for the construction of plasmid pUC-BABK

2.1.2 重組菌株S3-1的驗(yàn)證

以重組質(zhì)粒pUC-BAKB為模板擴(kuò)增片段BAKB,經(jīng)1.2.2法轉(zhuǎn)化到出發(fā)菌株S3后得到陽性轉(zhuǎn)化子S3G,同源重組過程如圖2所示。然后以出發(fā)菌株S3的DNA為陰性對照,以1-F/1-R 和2-F/2-R為上下游驗(yàn)證引物,對S3G進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果如圖3所示,對照菌S3無條帶;重組菌株S3G上游為542 bp,下游為731 bp,與預(yù)期條帶大小一致。證明KanMX片段已成功整合到出發(fā)菌株S3的基因組上,整合位點(diǎn)正確,BAT2基因被敲除。

圖2 同源重組過程Fig.2 The process of homologous recombining

M-2 kbp DNA Marker;1-重組菌株S3G中重組片段BAKB的上游驗(yàn)證;2-重組菌株S3G中重組片段BAKB的下游驗(yàn)證;3-出發(fā)菌株S3中重組片段BAKB的上游驗(yàn)證;4-出發(fā)菌株S3中重組片段BAKB的下游驗(yàn)證圖3 重組菌株S3G的PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR verification of the recombinant strain S3G

2.1.3KanMX抗性篩選標(biāo)記的去除

利用1.2.3的方法,去除存在于S3G基因組上的KanMX抗性基因,經(jīng)抗性平板篩選后,得到無抗性標(biāo)記基因的重組菌株S3-1,如圖4-a所示。

a-左:含G418抗性的YEPD平板;右:普通YEPD平板;b-M-2 kbp DNA Marker;1-重組菌株S3G中KanMX基因片段的擴(kuò)增;2-重組菌株S3-1中KanMX基因片段的擴(kuò)增圖4 重組菌株S3-1的驗(yàn)證Fig.4 Verification of the recombinant strain S3-1

S3-1的PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖4-b所示,以K-F/K-R為引物,重組菌株S3G為模板,能夠擴(kuò)增出1 631 bp的KanMX抗性基因片段;以重組菌株S3-1為模板,無法擴(kuò)增出目的條帶,證明重組菌株S3-1基因組中已無KanMX抗性基因。

2.1.4 pSH65質(zhì)粒的丟失

將重組菌株S3-1連續(xù)傳代至pSH65質(zhì)粒丟失,以Z-F/Z-R為引物,PCR驗(yàn)證如圖5所示,相比第1代S3-1,第8代S3-1無明顯條帶,表明S3-1傳至第8代時(shí)已丟失pSH65質(zhì)粒。

M-2 kbp DNA Marker;1,2,3-重組菌株S3-1第1,5,7代中Zeocin抗性基因的擴(kuò)增;4,5-重組菌株S3-1第8,9代中Zeocin抗性基因的擴(kuò)增圖5 pSH65質(zhì)粒丟失后的PCR驗(yàn)證Fig.5 PCR verification for the curing of plasmid pSH65

2.2 重組菌株D3-1的構(gòu)建

為提高同源重組效率,采用縮進(jìn)式[19]基因整合的方式,以BAT2基因中的一部分作為同源臂(BA1和BB1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.1 重組質(zhì)粒pUC-BA1KB1的構(gòu)建

采用酶切連接法構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-BA1KB1,構(gòu)建流程方法同2.1.1。

2.2.2 重組菌株的驗(yàn)證

對菌株S3-1進(jìn)行BAT2基因的2次敲除,操作流程同2.1.2。得到陽性轉(zhuǎn)化子D3G后,通過3-F/3-R和4-F/4-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證,結(jié)果如圖6所示,條帶符合預(yù)期大小,證明KanMX片段已成功整合到出發(fā)菌株S3-1的基因組上,第2個BAT2等位基因被敲除。

M-2 kbp DNA Marker;1-重組菌株D3G中重組片段BA1KB1的上游驗(yàn)證;2-重組菌株D3G中重組片段BA1KB1的下游驗(yàn)證;3-出發(fā)菌株S3-1中重組片段BA1KB1的上游驗(yàn)證;4-出發(fā)菌株S3-1中重組片段BA1KB1的下游驗(yàn)證圖6 重組菌株D3G的PCR驗(yàn)證Fig.6 PCR verification of the recombinant strain D3G

2.2.3KanMX抗性篩選標(biāo)記的去除

將菌株D3G的KanMX抗性基因去除后得重組菌株D3-1,流程同2.1.3,抗性平板篩選結(jié)果見圖7-a,PCR驗(yàn)證結(jié)果見圖7-b,證明重組菌株D3-1基因組中已無KanMX抗性基因。

a-左:含G418抗性的YEPD平板;右:普通YEPD平板;b-M-2 kbp DNA Marker;1-重組菌株D3G中KanMX基因片段的擴(kuò)增;2-重組菌株D3-1中KanMX基因片段的擴(kuò)增圖7 重組菌株D3-1的驗(yàn)證Fig.7 Verification of the recombinant strain D3-1

2.2.4 pSH65質(zhì)粒的丟失

將重組菌株D3-1連續(xù)傳代,以Z-F/Z-R為引物,PCR驗(yàn)證如圖8所示,D3-1傳至第8代時(shí)也已丟失pSH65質(zhì)粒。

2.3 重組菌株的生長性能比較

以出發(fā)菌株S3為對照,測定重組菌株S3-1和D3-1的生長曲線。如圖9所示,重組菌株S3-1的生長趨勢與S3一致,無明顯差異;而重組菌株D3-1的生長速率和生物量較S3均有下降,這可能是由于BAT2基因完全敲除后菌株對支鏈氨基酸的吸收能力受到了影響,從而減緩了菌體的生長速率[20]。

M-2 kbp DNA Marker;1-重組菌株D3-1第1代中Zeocin抗性基因的擴(kuò)增;2,3-重組菌株D3-1第8,9代中Zeocin抗性基因的擴(kuò)增圖8 pSH65質(zhì)粒丟失后的PCR驗(yàn)證Fig.8 PCR verification for the curing of plasmid pSH65

圖9 重組菌株S3-1、D3-1及出發(fā)菌株S3的生長情況Fig.9 The growth of strains S3,S3-1 and D3-1

2.4 重組菌株的發(fā)酵性能比較

將重組菌株S3-1、D3-1和出發(fā)菌株S3,同時(shí)進(jìn)行桑葚酒發(fā)酵試驗(yàn),發(fā)酵結(jié)束后比較各菌株的基本發(fā)酵性能。結(jié)果如表3所示,重組菌株S3-1、D3-1與出發(fā)菌株S3在相同條件下CO2失重、總酸、還原糖含量以及酒精度均無明顯差異(P>0.05),且都符合NY/T 1508—2017 綠色食品 果酒。表明BAT2基因的缺失對菌株的基本發(fā)酵性能無顯著影響。

表3 重組菌株S3-1、D3-1及出發(fā)菌株S3的發(fā)酵性能比較Table 3 Comparison of fermentation properties of strains S3,S3-1,D3-1

2.5 重組菌株的醇酯含量比較

參照方法1.3.3測定重組菌株和出發(fā)菌株發(fā)酵液中的高級醇含量,結(jié)果如圖10所示。相比于出發(fā)菌種S3,重組菌株的高級醇含量均有所下降,其中單敲除重組菌株S3-1的總高級醇降低了20.97%,為359.33 mg/L;雙敲除重組菌株D3-1降低了31.63%,為310.85 mg/L,達(dá)到了250～350 mg/L的適宜范圍[21]。其中,異丁醇和異戊醇下降明顯(P<0.01),S3-1分別降低了27.42%、22.86%,D3-1分別降低了40.53%、35.28%;而丙醇和苯乙醇無明顯變化(P>0.05),與LI等[10]的研究相似。

圖10 重組菌株S3-1、D3-1和出發(fā)菌株S3的發(fā)酵醪中高級醇生成量的比較Fig.10 Comparison of high alcohol yields in fermented mash of strains S3,S3-1,D3-1注:總高級醇含量為丙醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇含量之和;不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

BAT2基因的缺失可以使釀酒酵母的高級醇產(chǎn)量減少,并且BAT2等位基因的第2次敲除對釀酒酵母高級醇代謝仍具有顯著影響(P<0.05)。主要原因可能如下:(1)D3-1生物量的降低導(dǎo)致其產(chǎn)生的高級醇含量減少;(2)BAT2的缺失影響了Ehrlich途徑中的第一步反應(yīng)—轉(zhuǎn)氨作用,阻斷了釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)中纈氨酸和亮氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮酸[22],減少了異丁醇和異戊醇的前體物質(zhì),從而降低高級醇含量。并且當(dāng)出發(fā)菌株為二倍體時(shí),BAT2作為等位基因在基因組中會有2個拷貝,所以敲除基因的數(shù)量會與高級醇的含量呈負(fù)相關(guān)。但研究高級醇時(shí),其含量并不是越低越好,當(dāng)其含量過低時(shí),酒體單薄,不利于果酒的風(fēng)味和口感;含量過高時(shí)又會危害人體,所以達(dá)到適宜濃度的高級醇才是果酒的研究目的。

3 結(jié)論

本研究利用Cre/loxp系統(tǒng)和基因同源重組技術(shù),對出發(fā)菌株S3的BAT2基因進(jìn)行單敲除和雙敲除,得到重組菌株S3-1和D3-1。經(jīng)生長性能的測定,S3-1的生長趨勢與S3一致,但D3-1較S3有所減緩。桑葚酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,S3-1和D3-1的基本發(fā)酵性能與S3均無明顯差異,符合果酒釀造的基本要求。而高級醇生成量相比出發(fā)菌株有不同程度的降低,S3-1降低了20.97%,D3-1降低了31.63%,其中降低最為明顯的是異丁醇和異戊醇。這表明對釀酒酵母中BAT2基因的敲除可以在不影響基本發(fā)酵性能的同時(shí),降低桑葚酒中高級醇含量,提高桑葚酒品質(zhì),具有一定的實(shí)際應(yīng)用潛力。本研究僅探究了BAT2基因?qū)Ω呒壌忌闪康挠绊?在后續(xù)研究中可以繼續(xù)探究BAT2基因?qū)ο嚓P(guān)氨基酸轉(zhuǎn)化量和桑葚酒中其他風(fēng)味物質(zhì)生成量的影響,完善BAT2基因在高級醇代謝途徑中的作用機(jī)制。