劉夢麗，林欣媛，閆超雙，王方園，舒子璇，賈曉益，桂雙英,2,3,4

(1.安徽中醫(yī)藥大學；2.安徽省中醫(yī)藥科學院藥物制劑研究所；3.現(xiàn)代藥物制劑安徽省教育廳工程技術研究中心；4.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，主要病理表現(xiàn)為滑膜增生，血管翳形成，關節(jié)軟骨破壞等[1]。目前對RA的治療主要以藥物治療為主，治療藥物主要有非甾體抗炎藥、慢作用抗風濕藥物、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等[2]。上述藥物對于緩解臨床癥狀、控制病情進展具有顯著優(yōu)勢，但尚不能完全治愈和降低RA的致殘率[3-4]。近年來，傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療RA愈來愈受到人們的重視。復方青風藤巴布劑由青風藤和桂枝經(jīng)提取制備而成[5]，青風藤具有祛風濕，通經(jīng)絡，利小便的功效[6]。桂枝具有發(fā)汗解肌，溫通經(jīng)脈，助陽化氣，平?jīng)_降氣的功效[7]。二者配伍共奏祛風除濕、溫通經(jīng)脈、散寒止痛之功效。巴布劑具有載藥量大、使用方便、無污染等特點。因此，本實驗采用完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adjuvant，CFA)左后跖皮內(nèi)注射誘導大鼠佐劑型關節(jié)炎(Adjuvant Arthritis，AA)模型，觀察復方青風藤巴布劑對AA大鼠的保護作用，為復方青風藤巴布劑的進一步研究與開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物成年SD大鼠48只，SPF級，雄性，體質(zhì)量160～200 g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(皖)2017-001，動物倫理號：AHUCM-rats-2020016。動物均飼養(yǎng)于溫度(25±2)℃和濕度(50±10)%的屏障環(huán)境內(nèi)，標準顆粒飼養(yǎng)并自由飲水，每日光照12 h。實驗前，適應性飼養(yǎng)4 d以上。

1.2 主要試劑完全弗氏佐劑(Sigma，批號：SLBD0736)；戊巴比妥鈉(北京化學試劑有限公司，批號:061222)；青藤堿(純度≥98%，上海煦朗實業(yè)有限公司，批號SS105956)；氫氧化鈉(江蘇強盛功能化學股份有限公司，批號：20141025)；多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司，批號20140206)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20140102)；二甲苯(上海蘇懿化學試劑，批號：20140806)；蘇木精-伊紅染料(自制)；青風藤和桂枝飲片均購于安徽亳州藥材市場，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學楊青山副教授鑒定均為合格飲片；聚丙烯酸鈉NP-700(日本昭和公司，批號：0005488791)；甘油(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160721)；酒石酸(汕頭市達濠化工廠，批號：920128)；交聯(lián)聚維酮(PVPP，安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號：141006)；甘氨酸鋁(上海麥克林生化科技有限公司，批號：10042001)；卡波姆(南京威爾化工有限公司，批號：20110702)；三乙醇胺(上海試劑三廠，批號：0815)；氮酮(鄭州津北化工有限公司，批號：20140326)；丙二醇(江西益普生藥業(yè)有限公司，批號：20150501)；聚維酮K-90(PVPK-90，廣東粵美化工有限公司，批號：20160215)；生理鹽水(開開援生制藥有限公司，批號：14071734)。

1.3 儀器設備自動脫水機(湖北孝感，型號：亞光ZT-12M)；石蠟包埋機(湖北孝感，型號：亞光YB-7B)：切片機(德國，型號：Leica RM2135)；切片漂烘儀(安徽合肥電子研究所科，型號：力飛QP-B)；顯微鏡(德國，型號：Olympus BXS1)；數(shù)碼照相裝置(德國，型號：Olympus DP70)。

1.4 方法

1.4.1 復方青風藤巴布劑的制備 分別稱取青風藤360 g，桂枝90 g，加入6倍量90%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h。合并提取液，減壓濃縮，干燥得干浸膏[5]。取聚丙烯酸鈉NP-700 2.5 g、甘氨酸鋁0.08 g、PVPP 0.5 g、中藥干浸膏4.2 g和氮酮1.21 g加入11 g甘油中，攪拌均勻，作為A相；另取PVP-K90 0.8 g加20 g水溶解，加入酒石酸0.08 g充分溶解，作為B相；將B相加入到A相中，攪拌均勻，取適量灘涂于無紡布上，蓋上防黏層，壓制，即得[6]。

1.4.2 青藤堿凝膠的制備 取4 g卡波姆940于純水中溶脹過夜，精密稱取4 g青藤堿，用乙醇和丙二醇充分溶解后加入卡波姆溶液中，不斷攪拌至均勻，用三乙醇胺調(diào)pH至7.0，加純水至200 g，即得2%的青藤堿凝膠[8]。

1.4.3 AA模型建立 雄性SD大鼠48只，按體重大小編號后，隨機數(shù)表法抽取40只大鼠于左后跖皮內(nèi)注射CFA 0.1 mL制作AA模型[9]，余下8只作為空白對照組，同法注射0.1 mL生理鹽水。

1.4.4 分組與給藥 造模后第18天，用足趾容積測量儀測定大鼠非致炎側足爪容積，計算非致炎側足腫脹度(腫脹度=致炎后的足容積-致炎前的足容積[10])，根據(jù)大鼠足跖腫脹度將40只AA大鼠隨機分為5組，每組8只，即模型組，復方青風藤巴布劑高、中、低劑量組12.0、6.0、3.0 g/(kg·d)和陽性藥組。給藥前24 h，用剃毛機剃去大鼠腹部3 cm×3 cm長毛，從造模后第19天在腹部給藥，復方青風藤巴布劑高、中、低劑量組分別貼敷不同劑量的巴布劑[11]，陽性藥組涂抹青藤堿凝膠，模型組和空白對照組均貼敷空白基質(zhì)巴布劑，給藥1次/d，每次貼敷24 h，連續(xù)給藥7 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況 觀察大鼠體毛色澤，神志及活動狀態(tài)，飲食變化等情況。

1.5.2 體重 分別于造模前(0 d)和造模后第7天、10天、13天、16天、19天、22天、25天稱取各組大鼠的體重并記錄。

1.5.3 繼發(fā)側足爪腫脹度 分別于造模前(0 d)和造模后第7天、10天、13天、16天、19天、22天、25天用足趾容積測量儀測定大鼠非致炎側足爪容積。

1.5.4 細胞因子IL-1β和TNF-α 于末次給藥后12 h，腹腔3%戊巴比妥鈉麻醉，進行腹主動脈取血，靜置30 min后，離心10 min，轉(zhuǎn)速為3500 r/min，分離血清，-20 ℃冷凍保存，待測。IL-1β和TNF-α測定采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法，操作嚴格按照試劑盒說明書方法進行。

1.5.5 病理組織學檢測 于末次給藥12 h后，處死大鼠，取踝關節(jié)置于4%多聚甲醛固定，5%硝酸脫鈣，至用針刺入組織無阻力感為止。脫水、透明、石蠟包埋、切片及蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察踝關節(jié)組織滑膜細胞增殖情況、細胞侵蝕程度、血管翳形成以及軟骨表面光滑與否。

HE染色法：石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟→水化→蘇木素染色10 min(染細胞核)→鹽酸酒精分化→伊紅染色(染細胞漿)→梯度酒精脫水→二甲苯透明→樹脂膠封片→光學顯微鏡下觀察大鼠踝關節(jié)的病理表現(xiàn)。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料結果以“均數(shù)±標準差”表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析[6]或重復測量方差分析方法，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況造模成功的大鼠毛色較粗糙，精神倦怠，食量下降，大小便未見異常，注射佐劑部位的皮膚無潰爛，少許紅腫，大鼠行動較困難，急性炎癥出現(xiàn)時以爬行為主，有舔足、抖動的現(xiàn)象出現(xiàn)。待繼發(fā)側炎癥出現(xiàn)時，右足紅腫，但程度輕于致炎側；通過給予復方青風藤巴布劑和青藤堿凝膠治療后，上述癥狀有所緩解。

2.2 體重在前10 d各組大鼠的體重均一致增加，從第10天開始，除空白對照組外，其他致炎組體重均有所下降，至第16天，各致炎組大鼠體重明顯下降；自第19天開始治療后，除模型組外，各治療組大鼠體重均有所增加，至第25天，各治療組大鼠體重明顯增加，見表1。

表1 大鼠體重變化情況

2.3 繼發(fā)側足爪腫脹度與空白對照組相比，在第7天和第10天，各致炎組的繼發(fā)側足腫脹度無顯著性差異(P>0.05)，第16天，各造模組繼發(fā)側的足腫脹度顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明AA大鼠模型造模成功。從第19天測完繼發(fā)側足容積后開始給藥，與模型組相比，給藥后第4天，復方青風藤巴布劑高劑量組和中劑量組大鼠繼發(fā)側足腫脹度明顯減輕(P<0.05)；給藥后第7天，復方青風藤巴布劑各劑量組、陽性藥組大鼠足腫脹度均顯著減輕(P<0.05，P<0.01)，且復方青風藤巴布劑高劑量組的治療效果最好，優(yōu)于陽性藥組,見表2。

表2 大鼠繼發(fā)側足腫脹度變化情況

2.4 細胞因子IL-1β和TNF-α表達水平比較與空白對照組相比，模型組大鼠血清中細胞因子IL-1β、TNF-α水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，復方青風藤巴布劑高、中、低劑量組IL-1β、TNF-α水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中復方青風藤巴布劑高劑量組血清中細胞因子IL-1β和TNF-α的水平和空白對照組沒有顯著性差異(P>0.05)，說明高劑量組可以有效降低炎癥大鼠血清中細胞因子IL-1β和TNF-α的濃度至正常大鼠水平，且治療效果優(yōu)于中、低劑量組，見表3。

表3 大鼠血清中IL-1β和TNF-α表達水平比較

2.5 病理組織學檢測由HE染色結果可知，空白對照組大鼠均踝關節(jié)軟骨表面光滑，滑膜細胞排列平整，滑膜組織未見增生，無細胞侵蝕，無血管翳形成；模型組大鼠均出現(xiàn)大量血管翳，大量炎癥細胞浸潤，關節(jié)軟骨受損嚴重；復方青風藤巴布劑高劑量組大鼠均少見炎癥細胞浸潤和血管翳，關節(jié)軟骨表面較光滑；復方青風藤巴布劑中、低劑量組和陽性藥組大鼠均可見炎癥細胞浸潤和血管翳，關節(jié)軟骨表面出現(xiàn)中度和輕度不等的受損，見圖1。

圖1 各組大鼠踝關節(jié)病理切片圖(HE，×200)

3 討論

AA大鼠模型現(xiàn)已廣泛應用于RA發(fā)病機制及其相關藥物防治作用的研究中，是一種經(jīng)典的免疫性炎癥模型[12-13]。CFA是一種強大而有效的致炎劑，注射后能夠引起局部明顯且持續(xù)時間較長的炎癥痛，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛等基本炎癥反應特征，是建立慢性炎癥痛模型最常用的藥物[14-15]。本實驗中，大鼠左后跖皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑后，大鼠毛色較粗糙，精神倦怠，行動出現(xiàn)困難，并且可觀察到明顯的紅、腫癥狀，提示CFA成功誘導AA大鼠模型，為開展復方青風藤巴布劑對AA大鼠的藥效學研究提供了保障。

青藤堿是從傳統(tǒng)中藥青風藤中提取分離的一種生物堿單體，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制等藥理作用[16-17]。目前，青藤堿作為有效成分治療風濕和類風濕關節(jié)炎，臨床上主要劑型有片劑、腸溶膠囊劑、緩釋片、靜脈注射劑等制劑[18]。青藤堿凝膠貼劑是將青藤堿制成經(jīng)皮給藥制劑，可避免口服吸收制劑的首過效應及靜脈給藥易發(fā)生的不良反應，增加藥物在給藥部位的濃度積累并起到持續(xù)釋藥的作用。本實驗前期選擇腹部、踝關節(jié)兩個部位進行考察，由于大鼠足部病變部位面積小，無法滿足給藥需求，并且大鼠活動性強，無自覺意識，容易撕咬、掙脫巴布劑，給藥時間不能達到要求最終選擇腹部進行貼敷給藥。在腹部貼敷不僅有充足的給藥面積，同時加以膠帶固定還可以有效地減少大鼠撕咬、掙脫等情況出現(xiàn)，保證有效給藥時間。此外，本實驗選擇與青風藤巴布劑具有相同給藥方式的青藤堿凝膠貼劑作為陽性藥物所得實驗結果更能直觀、科學的反映青風藤巴布劑的治療優(yōu)勢，為該劑型的后續(xù)研發(fā)工作提供實驗依據(jù)。慢性炎癥疼痛涉及外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，具有復雜的病理過程。大量研究表明TNF-α和IL-1β在RA發(fā)病期間發(fā)揮著不可替代的作用，TNF-α可促進PEG、IL-1等釋放，使炎癥細胞進入關節(jié)腔，損傷關節(jié)滑膜和關節(jié)軟骨[19]；單核和巨噬細胞可以分泌IL-1β，其可誘導炎癥的發(fā)生，導致滑膜增殖，侵蝕軟骨，大量白細胞浸潤[20-21]。本實驗在前期課題組優(yōu)選出復方青風藤巴布劑藥材的最佳提取工藝和復方青風藤巴布劑的最佳基質(zhì)處方和制備工藝相關研究基礎上，在AA大鼠模型中考察了復方青風藤巴布劑的抗炎作用。結果表明復方青風藤巴布劑高劑量組可以有效地降低AA大鼠血清中TNF-α和IL-1β的濃度，并且療效優(yōu)于青藤堿凝膠(P<0.05，P<0.01)，說明本實驗制備的復方青風藤巴布劑在治療RA方面具有一定的療效。

綜上，本研究采用CFA誘導AA大鼠模型證實復方青風藤巴布劑對RA有治療作用，且可能與其抑制TNF-α和IL-1β有關，這將為復方青風藤巴布劑的進一步開發(fā)奠定基礎。