陳雪健 王偉 周健 李寧 張浩鵬 徐力善

瑞戈非尼(Regorafenib)是一種新的多激酶抑制劑，用于索拉非尼治療無(wú)效的晚期肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)患者[1]。瑞戈非尼可作用于多個(gè)靶點(diǎn)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，例如酪氨酸激酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(Platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(Fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)等[2]，這些因子參與許多細(xì)胞內(nèi)的分子調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)主要研究瑞戈非尼對(duì)人的肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響，以及其聯(lián)合AKT抑制劑哌立福辛(Perifosine)對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的作用，并且探討瑞戈非尼導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，為藥物治療肝癌提供新的理論基礎(chǔ)及新思路。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞系HepG2購(gòu)自黑龍江省分子醫(yī)學(xué)生物工程研究中心。培養(yǎng)細(xì)胞用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液，在5%CO2的恒溫(37℃)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用PBS沖洗并換液，每24 h一次，用胰蛋白酶消化并傳代，每1～2天一次，然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物、試劑及抗體

瑞戈非尼購(gòu)自上海阿拉丁生化有限公司；AKT抑制劑哌立福辛購(gòu)自美國(guó)MCE公司；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海東仁化學(xué)科技公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物公司；二甲基亞砜、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、胎牛血清、胰酶細(xì)胞消化液購(gòu)自上海碧云天公司；雙色預(yù)染蛋白Marker、ECL試劑盒、細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司；一抗β-actin、p-AKT、AKT、p21、p27、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率

用含有血清的培養(yǎng)液將HepG2細(xì)胞稀釋后，接種至96孔板，每孔2 000個(gè)細(xì)胞，將96孔板放入培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃)中，等待細(xì)胞貼壁后，將瑞戈非尼按照濃度梯度(0、1、5、10、15、20、25 μmol/L)依次加入96孔板中，其中0 μmol/L為對(duì)照組，每組中5個(gè)平行樣孔。培養(yǎng)48 h，然后將每孔的培養(yǎng)液吸出，加入CCK-8試劑，再次在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，取出后在450 nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀中測(cè)OD值。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞系，將其接種在培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁，PBS沖洗、換液，設(shè)置兩組實(shí)驗(yàn)條件，分別是0、5、10、20 μmol/L的瑞戈非尼單獨(dú)處理肝癌細(xì)胞和0、10 μmol/L的哌立福辛、20 μmol/L的瑞戈非尼及雙藥聯(lián)合(10 μmol/L的哌立福辛聯(lián)合20 μmol/L的瑞戈非尼)處理肝癌細(xì)胞。恒溫條件下培養(yǎng)48 h，把培養(yǎng)液倒入離心管中，接下來(lái)將胰蛋白酶(不含EDTA)消化下來(lái)的細(xì)胞也加入離心管中，離心機(jī)(1 000 r/min，5 min)離心后，棄上清液，PBS重懸，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，再次離心后棄掉上清液，離心管中加入蛋白緩沖液稀釋?zhuān)?xì)胞濃度為每毫升1×106個(gè)，抽取離心管中的細(xì)胞懸液100 μL，加入5 mL流式管中，根據(jù)說(shuō)明，Annexin Ⅴ-FITC及PI各5 μL加入流式管中，充分混勻，室溫下完全避光靜置，15 min后，400 μL的蛋白緩沖液加入各個(gè)流式管中，1 h內(nèi)完成凋亡檢測(cè)。

1.5 Western blot檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)情況

設(shè)置兩組實(shí)驗(yàn)條件，分別是0、5、10、20 μmol/L的瑞戈非尼單獨(dú)處理肝癌細(xì)胞和0、10 μmol/L的哌立福辛、20 μmol/L的瑞戈非尼及雙藥聯(lián)合(10 μmol/L的哌立福辛聯(lián)合20 μmol/L的瑞戈非尼)處理肝癌細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，放于冰塊中操作，PBS沖洗后，離心機(jī)(1 000 r/min，5 min)離心，而后棄掉上清，重復(fù)2～3次上述操作，加入裂解液裂解細(xì)胞，離心后，留取上清液，BCA試劑盒來(lái)配置顯色液，酶標(biāo)儀測(cè)蛋白濃度，最后蛋白樣品放入沸水中，5 min后取出，-80℃保存。蛋白(30～40 μg)上樣至各孔，先調(diào)節(jié)電壓80 V，開(kāi)始電泳，等待Maker進(jìn)入下層膠分離后，電壓改為120 V。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(電流為300 mA)，蛋白質(zhì)分子量的大小決定轉(zhuǎn)膜時(shí)間的長(zhǎng)短，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜放入封閉液中，室溫下封閉1～2 h，再用TBST洗膜1次，加入抗體β-actin、p-AKT、AKT、p21、p27、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9，一抗?jié)舛葹?∶1 000，在冰箱(4℃)中孵育過(guò)夜。然后洗膜3次，加入二抗(1∶2 000)，室溫下孵育2 h，再洗膜3次，最后在分子成像儀ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)下顯影分析。圖像通過(guò)Image LabTM軟件進(jìn)行量化，β-actin作為內(nèi)參，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 瑞戈非尼對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)置不同的瑞戈非尼藥物濃度梯度(1、5、10、15、20、25 μmol/L)來(lái)驗(yàn)證其對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)的抑制能力，用CCK-8法檢測(cè)肝癌細(xì)胞的存活率，在2 h時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，從瑞戈非尼濃度為5 μmol/L起，隨著瑞戈非尼藥物濃度增加，肝癌細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)，IC50為18.45 μmol/L(圖1)。

圖1 CCK-8檢測(cè)不同濃度瑞戈非尼處理肝癌細(xì)胞后的細(xì)胞存活率

2.2 瑞戈非尼對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用

設(shè)置不同濃度的瑞戈非尼(0、5、10、20 μmol/L)處理HepG2細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，研究發(fā)現(xiàn)，隨著瑞戈非尼的濃度增加，細(xì)胞凋亡率也顯著上升，與對(duì)照組相比，瑞戈非尼濃度為5、10、20 μmol/L時(shí)的凋亡率從6.89±2.74%分別上升至17.77±4.47%(P<0.05)，37.59±6.87%(P<0.01)及55.14±8.31%(P<0.01)(圖2)。所以瑞戈非尼可促進(jìn)HepG2細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡。

圖2 不同濃度瑞戈非尼處理肝癌細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡的情況

2.3 瑞戈非尼對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步研究瑞戈非尼在促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡方面的分子機(jī)制，本研究采用不同濃度的瑞戈非尼處理肝癌細(xì)胞48 h后，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)變化。研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，隨著瑞戈非尼濃度的增加，p21、p27、Bax、Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9的蛋白表達(dá)量明顯增高(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2、p-AKT的蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)(圖3)。

圖3 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.4 瑞戈非尼與哌立福辛聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響

本研究用哌立福辛、瑞戈非尼及瑞戈非尼聯(lián)合哌立福辛處理肝癌細(xì)胞，處理48 h。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率情況：雙藥聯(lián)合組的凋亡率(58.05±4.89)%明顯高于哌立福辛組凋亡率(14.07±2.84)%(P<0.01)及瑞戈非尼組凋亡率(29.68±3.07)%(P<0.05)(圖4A，圖4B)。用Western blot分析凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(P<0.01)、哌立福辛組(P<0.05)和瑞戈非尼組(P<0.05)比較，雙藥聯(lián)合組Bcl-2、P-AKT表達(dá)量下降以及Bax表達(dá)量增加(圖4C，圖4D)。結(jié)果表明瑞戈非尼聯(lián)合AKT抑制劑哌立福辛對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的作用比單藥更加顯著。

圖4 瑞戈非尼與哌立福辛聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)肝癌細(xì)胞的影響

3 討論

肝細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其在男性中居第5位，在女性中居第7位，全球內(nèi)的肝癌發(fā)病率有逐年升高趨勢(shì)[3]。導(dǎo)致肝癌的危險(xiǎn)因素有許多，其中乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染占54%，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染占31%，其它因素包括飲酒、代謝等[4]。根治性手術(shù)切除腫瘤或者肝移植可能治愈肝癌[5]，但是對(duì)于晚期肝癌患者幾乎無(wú)法進(jìn)行外科治療。研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼作為多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，可以抑制腫瘤的血管生成及抑制腫瘤的增殖[6]。索拉非尼在2007年被批準(zhǔn)用于肝癌[7]，對(duì)于應(yīng)用索拉非尼治療后仍進(jìn)展的肝癌，可應(yīng)用瑞戈非尼。瑞戈非尼是第一種被批準(zhǔn)的用于肝癌的二線(xiàn)藥物。瑞戈非尼是比索拉非尼抑制范圍更廣泛的酪氨酸激酶，并且抑制作用更強(qiáng)[8]。

p21、p27作為細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑家族中的重要的成員[9]，當(dāng)p21或p27接受到由細(xì)胞內(nèi)、外產(chǎn)生的刺激時(shí)，其表達(dá)上調(diào)，來(lái)確保細(xì)胞適當(dāng)?shù)挠薪z分裂，及時(shí)使細(xì)胞周期停滯，起到抑癌作用，相反，其低表達(dá)時(shí)起到致癌基因的功能[10-11]。AKT又被稱(chēng)為蛋白激酶B，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、周期、增殖等方面起著重要作用[12]，AKT的異常與腫瘤發(fā)生、代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及心血管疾病等都有一定程度關(guān)系[13]。本研究結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)瑞戈非尼處理后，p21、p27表達(dá)增加，p-AKT表達(dá)減少，表明腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制。

細(xì)胞凋亡的調(diào)控與Bcl-2蛋白家族有極大的相關(guān)性[14]，Bcl-2蛋白家族分為兩類(lèi)：促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白。Bcl-2蛋白是其中一種抗凋亡蛋白，與許多腫瘤的發(fā)生有關(guān)[15-16]。Bax與Bcl-2為互相拮抗的關(guān)系，Bax通過(guò)與Bcl-2結(jié)合為二聚體來(lái)調(diào)節(jié)Bcl-2[17]。Caspase家族與細(xì)胞的凋亡息息相關(guān)[18-19]，其中Caspase-8、Caspase-9參與細(xì)胞凋亡的起始步驟，然后其將凋亡信號(hào)向下傳導(dǎo)直至執(zhí)行凋亡程序[20]。因此本研究選取相關(guān)的蛋白檢測(cè)其表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增加，Bax表達(dá)水平增高，Bcl-2表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9等蛋白表達(dá)增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明瑞戈非尼能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。并且，本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同時(shí)加入哌立福辛后，雙藥聯(lián)合組對(duì)Bax、Bcl-2及p-AKT表達(dá)的影響程度明顯大于哌立福辛組和瑞戈非尼組，因此可以認(rèn)為瑞戈非尼與哌立福辛聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡效果更顯著。

綜上所述，瑞戈非尼通過(guò)上調(diào)p21、p27、Bax、Caspase-8、Caspase-9，下調(diào)Bcl-2、p-AKT誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，并且瑞戈非尼與哌立福辛聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡效果更顯著，為藥物治療肝癌提供了新的理論基礎(chǔ)及思路，對(duì)于今后臨床治療肝癌起到了積極作用。