劉道權(quán)，宋 丹，鄢 華，蘇 晞

急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）是一種由急性冠脈和持續(xù)性缺氧缺血引起的心肌缺血。AMI的病理進程中免疫失調(diào)以及炎癥反應(yīng)增加是其關(guān)鍵特征之一[1]。AMI大鼠中炎癥細胞因子出現(xiàn)過表達，其中包括腫瘤壞死因子?α（(tumor necrosis factor?α,TNF?a）、白介素?1β（(interleukin?1β,IL?1β）、IL?6[2]。此外，已證明TNF?α在肥胖的人或小鼠的肌肉組織中過表達，且TNF?α能夠增加嗜中性粒細胞的吞噬能力，促進內(nèi)皮細胞分泌IL?1和IL?6，增強嗜中性粒細胞和內(nèi)皮細胞的粘附力，從而刺激局部炎癥性擴張和對AMI 的反應(yīng)[3-4]。多種信號均可有效調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，如膽堿能抗炎信號通路[5]，而尼古丁（煙堿型ACh受體的激動劑）可以減少缺血再灌注損傷動物體內(nèi)促炎性細胞因子的產(chǎn)生[5]。因此，膽堿能抗炎途徑不僅是重要的生理機制，而且是治療干預(yù)AMI免疫炎癥的潛在靶標(biāo)。

煙堿型ACh 的跨膜受體α7nAChR 在腦中豐富表達，且在多種非神經(jīng)元細胞中也表達，包括上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、免疫細胞、癌細胞[6]。α7nAChR對于膽堿能抗炎作用至關(guān)重要。最新研究表明，敲除α7nAChR 加重心肌梗死并增加了系統(tǒng)炎癥[7]。然而，在AMI 中連接α7nAChR 激活和調(diào)節(jié)促炎細胞因子的機制仍然不清楚。

微小RNA（miRNA）是18~25個核苷酸的非編碼轉(zhuǎn)錄本，在大多數(shù)情況下，成熟的miRNA通過種子區(qū)域成熟的mRNA的3?UTR序列結(jié)合，若種子區(qū)完全匹配，可引起mRNA降解，若部分匹配，則抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄。研究表明miR?124可被激活后的α7nAChR誘導(dǎo)表達[8]，而且 miR?124 可以抑制 TNF?α 轉(zhuǎn)化酶（TNF?α converting enzyme,TACE）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and transcriptional activators 3, STAT3），這兩種酶分別控制 TNF?α、IL?1、IL?6 的表達[8]?；谝陨涎芯客茰y，在 AMI中α7nAChR 也可能通過miR?124 參與調(diào)節(jié)免疫炎癥。本研究假設(shè)α7nAChR可能是AMI免疫失衡和炎癥增加的潛在治療靶點，本研究旨在討論α7nAChR激活后調(diào)節(jié)miR?124/TACE對心肌梗死大鼠炎癥和免疫功能的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑與耗材 GTS?21（3?[(2,4?dimethoxy)benzylidene]?anabaseinedihydrochloride，DMXBA）購于美國MedChemExpress 公司。70 只SD 大鼠購于武漢亞洲心臟病醫(yī)院動物實驗中心。裂解緩沖液和戊巴比妥鈉均購于天根生物技術(shù)（北京）有限公司。1.5%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑購于美國sigma 公司。肌酸激酶CK測定試劑盒購于南京建城生物工程 研 究 所 ；血 清 CK ?MB（ARB10700）和 cTnT（ARB13662）的ELISA 試劑盒均購于美國Rapidbio公司。LDH 的活性檢測試劑盒購于南京建城生物工程研究所。NF?κB，TNF?α，IL?1β和IL?6的ELISA試劑盒均購于武漢Uscn Life 科學(xué)有限公司。雙辛可寧酸（BCA）蛋白測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所。硝酸纖維素膜購于美國Millipore公司。Ecl化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)購于南京諾唯贊生物科技有限公司。兔抗鼠的α7nAChR、TACE 和GAPDH抗體均購于美國Abcam公司。FITC偶聯(lián)的抗CD3，PE?A偶聯(lián)的抗CD8和FITC?A偶聯(lián)的抗CD4的抗體均購于美國Abcam 公司。miR?124 的擬似物（mimic）和mimic 陰性對照（NC）以及miR?124 抑制劑（inhibitor）均購于上海吉瑪公司。用TACE 3'UTR 野 生 型 序列（TACE?3'?UTR?wt）和 突 變 的TACE 的 3'?UTR 序列（TACE?3'? UTR-mut）構(gòu)建的熒光素酶報告載體均由上海碧云天公司構(gòu)建。

1.2 動物模型 70只SD大鼠（8~10周，體質(zhì)量250~300 g），在（23±1）℃，相對濕度50%，12 h明暗循環(huán)環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水采食。實驗大鼠在接受戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹膜內(nèi)麻醉后，在第3和第4肋間隙之間左胸骨邊界開胸；除去心包，將左心室表面的心臟和血管分開。使用1~2 mm 5?0 絲線將左冠狀動脈前降支結(jié)扎在左心耳下方；然后注射青霉素和鏈霉素，以防止感染。通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支制備AMI 大鼠模型，60 只AMI 模型大鼠建立成功。10只大鼠進行了假手術(shù)，除未進行冠狀動脈結(jié)扎，其余過程與AMI組一致[9]。

1.3 動物分組和藥物注射 將GTS?21（5、10 和20 mg/kg）溶于生理鹽水中。將AMI 模型的60 只大鼠隨機數(shù)字表法分為6 組，每組10 只大鼠：AMI 組即模型組。其余 5 組分別為 GTS?21?5、GTS?21?10、GTS?21?20、inhibitor+GTS?21?20 組、mimic+GTS?21?20 組，分別對應(yīng)的是 5、10 和 20 mg/kg GTS?21 靜脈注射大鼠 1 周，1 次/d，以及 20 mg/kg GTS?21 聯(lián)合1.5 μmol/L 的 inhibitor 靜脈注射大鼠 1 周，1 次/d 和20 mg/kg GTS?21及聯(lián)合 1.5 μmol/L 的mimic 靜脈注射大鼠1 周，1 次/d。未進行冠狀動脈結(jié)扎的為sham組。

1.4 梗死面積測量 注射水合氯醛麻醉大鼠，通過斷頭處死所有實驗大鼠。將心臟通過主動脈插管，并用生理鹽水洗滌。結(jié)扎冠狀動脈6 h 后，將左心室在?80℃下孵育5 min，然后切成2 mm 的切片。與2,3,5-三苯基氯化四氮唑共孵育后，無染色的心臟區(qū)域表示缺血性心肌，而染成紅色的區(qū)域表示心肌正常。通過占左心室的百分比大小來測量sham組、AIM 組、GTS?21?5 組、GTS?21?10 組、GTS?21?20組的梗死區(qū)域面積。

1.5 檢測 CK、CK?MB、LDH、cTnT 冠狀動脈結(jié)扎后6 h 從腔靜脈采集大鼠血清樣品。將樣品以3 500×g 離心5 min，確定心肌特異性酶肌酸激酶（creatine kinase, CK）、CK 的MB 同工酶（creatine kinase?isozyme MB, CK?MB）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase, LDH）、心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin,cTnT）的水平。使用CK 試劑盒檢測CK 的活性。CK?MB、cTnT 的活性通過 CK?MB 和 cTnT 的ELISA 試劑盒進行定量。根據(jù)制造商的說明使用比色法分析 sham 組、AIM 組、GTS?21?5 組、GTS?21?10組、GTS?21?20組的LDH的活性。

1.6 NF?κB，TNF?α，IL?1β 和IL?6 水平檢測 在3 h的缺血期之后，將全血樣品在血清分離管中凝結(jié)30 min。然后將血清樣品以1 000×g 離心25 min，并保持在?80°C下直至進一步使用。嚴格按照市售NF?κB，TNF?α，IL?1β 和IL?6 的 ELISA 試劑盒說明，檢測血清中 sham 組、AIM 組、GTS?21?5 組、GTS?21?10 組、GTS?21?20 組、inhibitor+GTS?21?20 組的 NF?κB，TNF?α，IL?1β和IL?6的水平。

1.7 實時定量PCR（Real?time quantitative PCR,RT?qPCR） 使用TRIzol一步法從心肌細胞和心肌組織中提取總RNA。通過測定總RNA 的質(zhì)量，并相調(diào)節(jié)RNA濃度。采用兩步法對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。使用以下反應(yīng)條件：70 ℃、10 min，冰浴2 min，42 ℃、60 min和70 ℃、10 min。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA暫時置于?80 ℃，并用 RT?qPCR 對 cDNA 進行定量。RT?qPCR 的反應(yīng)條件如下：在95 ℃下預(yù)變性30 s的一個循環(huán)，隨后在95 ℃下進行40 個循環(huán)的10 s 變性，在60 ℃下退火10 s。并在70 ℃下延伸10 s。U6用于miR-124的內(nèi)參基因，使用相對定量方法。采用2?ΔΔCt計算每個靶基因的相對表達倍數(shù)。

1.8 熒光素酶報告基因?qū)嶒?利用生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站 microRNA.org 預(yù)測 miR?124 靶基因，并精確預(yù)測miRNA 可識別得潛在靶位點。利用含有miR?124結(jié)合位點的TACE 3'UTR野生型序列（TACE?3'?UTR?wt）和突變的 TACE 的 3'?UTR 序列（TACE?3'?UTR?mut）構(gòu)建熒光素酶報告載體，并將其轉(zhuǎn)染到H9C2大鼠心肌細胞中。使用熒光素酶報告基因測定試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.9 蛋白免疫印跡分析檢測TACE蛋白表達 心臟樣本中提取總蛋白，儲存于?80 ℃。心肌樣本于冰冷的裂解緩沖液中勻漿。在4 ℃下以13 200×g 離心20 min 后，收集上清液，并使用雙辛可寧酸（BCA）蛋白測定試劑盒對總蛋白水平進行定量。然后通過SDS?PAGE 分離蛋白質(zhì)樣品（50~70 μg），并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜用含5%脫脂牛奶和 0.1%吐溫?20 的 10mM Tris?HCl 封閉，在室溫下靜置 1~2 h，然后與抗 α7nAChR（1：800）、抗TACE（1：600）和抗GAPDH（1：1 000）共孵育，4℃過夜。用含TBST 溶液洗滌3 次后，將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（1：5 000）在室溫下孵育2 h。使用增強的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)將結(jié)合的抗體顯色，并用X 射線膠片曝光。GAPDH 用作相對定量的內(nèi)參蛋白。使用Image?Proplus 軟件6.0分析每個樣品的表達水平。

1.10 流式細胞術(shù)檢測血液CD3+、CD4+和CD8+細胞亞群比例 使用的熒光染料偶聯(lián)的單克隆抗體是FITC偶聯(lián)的抗CD3，PE?A偶聯(lián)的抗CD8和FITC?A 偶聯(lián)的抗 CD4，在室溫與 sham 組、AIM 組、GTS-21?5組、GTS?21?10組、GTS?21?20組、inhibitor+GTS?21?20 組的血液單個核細胞分別孵育1 h。根據(jù)制造商的說明進行CD3，CD4 和CD8 的流式細胞儀分析。在BD FACSCalibur 上收集熒光數(shù)據(jù)，并使用FlowJo軟件進行分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析所有數(shù)據(jù)。具有正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）。單因素方差分析用于多個組之間的比較，Bonferroni 法兩兩比較校正P值。t檢驗分析用于熒光素酶報告實驗結(jié)果中兩組間的比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AMI 大鼠模型心肌損傷變化 AMI 組的梗死面積（42.15±2.11）%與sham 組（27.14±2.17）%比較，AMI 組梗死面積增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。使用α7nAChR 激動劑GTS?21（5、10、20 mg/kg）治療后，梗死面積減少至（34.86±1.61）%、（32.56±2.01）%和（31.94±1.79）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05，n=10）。另外，GTS?21 治療后，原本被AMI 上調(diào)的心肌特異性酶（CK，CK?MB，LDH和cTnT）活性均被GTS?21下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。圖1、表1。

表1 AMI大鼠的心肌損傷標(biāo)志物數(shù)值

圖1 AMI大鼠心肌組織的三苯基氯化四氮唑染色

2.2 AMI 大鼠模型中NF?κB、TNF?α、IL?1β、IL?6 的活性 與sham 組（11.6±1.10）ng/mg比較，AMI組的NF?κB 活性提高至（57.05±4.31）ng/mg（P<0.05）。用GTS?21（5、10、20 mg/kg）處理后，NF?κB活性降低至（38.21±2.29）ng/mg（P<0.05）、（32.25±2.89）ng/mg（P<0.05）、和（29.18±6.33）ng/mg（P<0.05）。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與sham 組（66.87±6.32 pg/mg）比較，AMI 組的 TNF?α 活性增加至（299.42±8.03）pg/mg，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在GTS-21 治療組（5、10、20 mg/kg）中，TNF?α 活性降低至（202.13±9.11）pg/mg（P<0.05），（187.8±8.41）pg/mg（P<0.05），（175.32±6.32）pg/mg（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與 sham 組比較，AMI 載體組的 IL?1β 和IL?6 的活性提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。在GTS?21 治療組（5、10、20 mg/kg）中，IL?1β 和IL?6的活性降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。蛋白免疫印跡檢測 TACE 的表達，與 sham 組比，AMI 組的TACE 表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在GTS?21 治療組，TACE 的表達均下調(diào)。差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），圖2。

圖2 AMI大鼠模型中NF?κB，TNF?α，IL?1β和IL?6的活性

2.3 AMI 大鼠 CD3+、CD4+、CD8+細胞的百分率變化 與sham 組中的（56.23±2.66）%比較，AMI 組的CD3+百分率活性提高至（73.6±7.36）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。用GTS?21（5、10、20 mg/kg）處理后，CD3+百分率降低至（68.21±5.33）%（P<0.05）、（64.25±7.89）%（P<0.05）、（59.44±3.92）%（P<0.05，n=10）。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與sham組中CD4+:CD8+的比率（1.85±0.11）比較，AMI 組的CD4+:CD8+的比率降低為（1.32±0.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。用GTS?21（5、10、20 mg/kg）處理后，CD4+:CD8+的比率升高為（1.49±0.17）（P<0.05）、（1.56 ± 0.08）（P<0.05）、（1.68 ± 0.35）（P<0.05）。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，圖3A，3B。

圖3 急性心肌梗死大鼠血液中的（A）CD3+細胞的百分率和（B）CD4+/CD8+的比率

2.4 激活 α7nAChR 對miR?124 的影響 使用GTS?21 治療 AMI 大鼠后，心肌組織中的 α7nAChR 的蛋白表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖4A）。另外，本研究發(fā)現(xiàn) GTS?21?20 治療后，心肌組織中miR?124 增加到近4 倍（圖4B），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖4 急性心肌梗死大鼠模型中α7nAChR和miR?124的表達

2.5 TACE 是 miR?124 的靶基因 如圖 5，TACE mRNA 3’?UTR 區(qū)域和 miR?124 的序列具有結(jié)合位點。使用熒光素酶報告基因法驗證miR?124 在預(yù)測的結(jié)合位點具有功能。圖5 顯示，mimic 對Mut?TACE 的熒光素酶活性的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），mimic 降低了 wt?TACE 的熒光素酶活性強度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。另外結(jié)果顯示mimic 可以抑制TACE 的體外表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而 NC 組對 TACE 的表達并無影響（P>0.05）。

圖5 熒光素酶基因報告實驗檢測大鼠心肌細胞中miR?124和TACE?3’UTR的結(jié)合作用

2.6 miR?124 抑制劑阻斷 GTS?21 的治療效果 由于 GTS?21 心肌組織中 miR?124 增加到近 4 倍，本研究使用miR-124 的抑制劑（inhibitor）后，與GTS?21?20組比較（29.18±6.33 ng/mg），inhibitor+GTS?21?20組的的NF?κB活性（50.23±3.55 ng/mg）增高。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但是仍低于AMI 組（57.05±4.31 ng/mg），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，n=10）。與GTS?21?20 組[（175.32±6.32 pg/mg）、（3.69±0.26 pg/mg）、（2.98±0.45 pg/mg）]比較，inhibitor+GTS?21?20 組的TNF?α、IL?1β、IL?6 的活性分別增加至（229.48±7.88 pg/mg）、（5.19±0.33 pg/mg）、（3.34±0.52 pg/mg）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而inhibitor+GTS?21?20 組 TNF?α、IL?1β、IL?6 的活性均低于AMI 組[（299.42±8.03 pg/mg）、（6.89±0.43 pg/mg）、（5.46±0.29 pg/mg）]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，n=10）。另外，與GTS?21?20 組CD4+:CD8+的比率（1.58±0.12）比較，inhibitor+GTS?21?20 組的 CD4+:CD8+的比率降低為（1.45±0.08），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而且仍高于AMI組的CD4+:CD8+的比率（1.32±0.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

最后，我們利用miR?124的擬似物（mimic）降解TACE，與 GTS?21?20 組比較（1.00±0.09），mimic+GTS?21?20組的TACE 蛋白的相對表達水平（0.07±0.02）被顯著抑制（P<0.05，n=10）（圖6）；與GTS?21?20組（29.18±6.33 ng/mg）比較，mimic+GTS?21?20組的NF?κB 的活性（25.10±1.44）ng/mg 降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，n=10）。與 GTS?21?20 組[（175.32±6.32 pg/mg）、（3.69±0.26 pg/mg）、（2.98±0.45 pg/mg）]比較，mimic+GTS?21?20組的TNF?α、IL?1β、IL?6的活性分別降低至（150.22±10.98 pg/mg）、（3.04±0.19 pg/mg）、（2.55±0.16 pg/mg），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與GTS?21?20 組CD4+:CD8+的比率（1.58±0.12）比較，mimic+GTS?21?20 組的CD4+:CD8+的比率升高為（1.72±0.07），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖6 Western blot檢測急性心肌梗死大鼠模型中TACE的蛋白表達

3 討論

目前，心肌梗死仍然是人類死亡的主要原因之一。多項研究表明，免疫炎癥誘發(fā)的促炎性細胞因子分泌失調(diào)在心肌梗死發(fā)展中起關(guān)鍵作用[10]。同時免疫功能的異常對心肌缺血或心力衰竭的病理發(fā)展其關(guān)鍵作用。有研究顯示，心肌缺血誘發(fā)免疫細胞因子增加，并對心肌造成進一步損害[11]。免疫細胞因子異常升高不僅抑制心肌細胞功能，而且也是導(dǎo)致心肌細胞損害、心臟重構(gòu)等病理變化的重要原因[11]。本研究發(fā)現(xiàn)促炎性細胞因子TNF?α 及其轉(zhuǎn)化酶TACE 在AMI 中上調(diào)，但是我們激活α 7nAChR 后 TACE 可被 miR-124 特異性負調(diào)節(jié)，同時激活α7nAChR 可以明顯改善AMI 的心肌梗死特征、免疫功能和炎癥水平，表明α7nAChR 是心肌梗死免疫功能和炎癥水平的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

機體免疫細胞平衡以及抗炎反應(yīng)是體現(xiàn)機體免疫功能的關(guān)鍵指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，使用α7nAChR激動劑PNU282987處理后，可以修復(fù)糖尿病引起的傷口愈合并且明顯改善機體內(nèi)免疫失衡[12]。本研究同樣表明GTS?21 可以降低CD3+細胞數(shù)并恢復(fù)CD4+/CD8+的細胞比率。本研究還觀察到，當(dāng)聯(lián)合GTS?21 和 miR?124 抑制劑處理后，CD4+/CD8+的細胞比率比 GTS?21 組降低。表明 GTS?21 激活 α 7nAChR后能通過改善AMI大鼠的免疫平衡從而保護AMI心肌損傷，激活α7nAChR導(dǎo)致miR?124的表達增加是其關(guān)鍵作用機制之一。

最新的研究表明，炎癥反應(yīng)在缺血性心臟病的發(fā)展和進程中起著重要的作用。NF?κB 是AMI 期間心臟組織中的炎性因子，是與各種生物學(xué)過程相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[13]。NF?κB?p65是NF?κB 的主要反式激活轉(zhuǎn)錄激活因子，在炎癥過程中具有調(diào)節(jié)功能[14]。促炎細胞因子已被證明在AMI期間被上調(diào)，其中最重要的是TNF?α，IL?1β 和IL?6[15]。且TNF?α，IL?1β和 IL?6 的激活受 NF?κB 調(diào)節(jié)[14]。已發(fā)現(xiàn) α7nAChR的藥理激動劑可改善缺血再灌注損傷[16]。然而，在心肌梗死中的作用仍鮮有研究。α7nAChR 的藥理激動劑具有抗氧化，抗炎和抗凋亡的作用。先前的研究表明，α7nAChR 的激動劑PNU282987 可劑量依賴性減少炎癥因子 TNF?α 和 IL?6 的分泌[17]。另一篇研究缺血后心肌組織的研究也證實，PNU282987 治療后 TNF?α、IL?6、及 p?NF?κBp65（Ser536）在心肌組織中表達明顯降低[18]。本研究結(jié)果與之一致，本研究使用另一種α7nAChR 激動劑GTS?21 對AMI 大鼠注射后，其心肌組織中的 α7nAChR 表達明顯增多，而且 TNF?α、TACE、IL?6、IL?1β、NF?κB 均明顯降低。因此，結(jié)果表明，α7nAChR 激動劑有明顯的抗AMI 炎性反應(yīng)的作用，而且α7nAChR激動劑可能通過抗炎機制保護AMI心臟損傷。

α7nAChR 激動劑具有明顯的心肌保護功能。AMI的梗死面積和心肌特異性酶（CK，CK?MB，LDH和cTnT）的表達水平高低是評估AMI 引起的心臟損害的重要指標(biāo)。CK，CK?MB 和cTnT 廣泛分布在心肌細胞的細胞質(zhì)上，并且接受AMI的大鼠中CK，CK?MB 和cTnT 的活性。我們的研究發(fā)現(xiàn)AMI組的梗死面積明顯增多，但是GTS?21 治療后，梗死面積大幅度減少，而且心肌特異性酶（CK，CK?MB，LDH和 cTnT）活性均被 GTS?21 下調(diào)。Li 等[18]的研究支持我們的結(jié)果，使用α7nAChR 激動劑PNU282987處理后，血清cTnI 和CK?MB 水平明顯降低。本研究表明，α7nAChR 激動劑降低AMI 大鼠模型的心肌梗死面積以及CK，CK?MB，LDH 和cTnT 活性，從而表明α7nAChR對AMI具有心臟保護作用。

研究表明，LPS 適度誘導(dǎo)的 miR?124 高表達后可以靶向抑制 TACE 并影響 TNF?α 分泌的能力[8]。而本研究中α7nAChR 激動劑誘導(dǎo)心肌組織中miR?124的水平，而α7nAChR 激動劑同樣可抑制心肌組織中的TACE 水平。并且，我們的熒光素酶基因報告實驗證實TACE 是miR?124 在心肌細胞中的靶基因，miR?124 抑制TACE 的表達。我們觀察到 α7nAChR 激動劑使 TNF?α 的水平明顯降低，而在聯(lián)合使用α7nAChR 激動劑和miR-124 的抑制劑后，TNF?α 的水平反而增高表明 α7nAChR 通過miR?124 抑制 AMI 大鼠的TNF?α 的水平。miR?124抑制劑對 NF?κB、IL?6 和IL?1β 的影響均有類似的效果。另外，研究同樣證實miR?124 可以對STAT3進行下調(diào)從而限制STAT3 對IL?6 的正反饋，導(dǎo)致IL?6 分泌降低[19]。這表明 α7nAChR 激動劑對 miR?124 的正調(diào)節(jié)從而對 TNF?α、IL?6、IL?1β 的表達均有抑制作用。因此以上研究表明，α7nAChR 激活后通過促進miR?124 的表達，從而影響AMI 的免疫炎癥和促炎因子的分泌。

總之，本研究表明α7nAChR 激活后能夠減輕AMI 引起的免疫炎癥失調(diào)。α7nAChR 激活的心臟保護作用可能與負調(diào)節(jié)miR?124 介導(dǎo)炎癥傳導(dǎo)有關(guān)。因此α7nAChR 激動劑對AMI 的治療具有潛在的應(yīng)用價值。