丁毅偉，孫希萌

血流感染是住院患者發(fā)病和死亡的主要原因[1-2]，血流感染患者的生存率與最初給予適當(dāng)?shù)目咕幬镞M(jìn)行經(jīng)驗性治療相關(guān)。因此，快速鑒定病原菌尤為重要[3]。有研究表明，接受充分實證治療的厭氧菌血流感染患者的死亡率顯著低于未接受充分實證治療的患者[4]。因此，在獲得藥敏試驗結(jié)果之前，更早和準(zhǔn)確的病原菌鑒定對于選擇合適的抗菌藥物非常重要[5]。許多直接從陽性血培養(yǎng)樣本中鑒定病原菌的方法表現(xiàn)出了不同的性能[6-8]。

本研究中HB&L 微生物培養(yǎng)儀國內(nèi)剛通過認(rèn)證并且在臨床論證階段，目前僅應(yīng)用于尿液和體液的快速培養(yǎng)，可以短時間內(nèi)診斷樣本陰性或陽性。其采用Alifax 專利激光散射技術(shù)，原理是將激光作為光源，以檢測散射光強(qiáng)度、頻移及其角度依賴等而得到粒子的相關(guān)信息。在本研究中基于激光散射技術(shù)用來監(jiān)測培養(yǎng)瓶中病原菌的生長，散射信號被計算和轉(zhuǎn)化為生長曲線，實時推算培養(yǎng)瓶中的細(xì)菌濃度，當(dāng)達(dá)到預(yù)設(shè)濃度后機(jī)器報警提示，這個過程僅需1~3 h，而傳統(tǒng)的血培養(yǎng)陽性樣本平板繼代培養(yǎng)時間為24 h，大大縮短其時間，獲得的陽性菌液直接離心取沉淀，分別用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI?TOF MS)直接鑒定，同時聯(lián)合VITEK 2 Compact微生物儀直接藥敏試驗（簡稱快速直接法），并以常規(guī)方法為參考，對快速直接法用于血培養(yǎng)陽性樣本革蘭陽性球菌鑒定以及藥敏的準(zhǔn)確性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及其來源 收集解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心門診及住院患者141 份革蘭陽性球菌血培養(yǎng)陽性樣本。本研究經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心倫理委員會批準(zhǔn)（201917100）。

1.2 儀器與試劑 Alifax HB&L微生物培養(yǎng)儀（意大利Alifax公司），Bruker MALDI?TOF 質(zhì)譜儀（德國布魯克公司）；全自動微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)VITEK 2 Compac（t法國梅里埃公司）；血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（鄭州安圖生物工程股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 快速直接法 收集141 例革蘭陽性球菌血培養(yǎng)陽性樣本，從血培養(yǎng)瓶中取10μL 陽性菌液轉(zhuǎn)種于 2 mL 的 HB&L 培養(yǎng)液瓶中，HB&L 微生物培養(yǎng)儀設(shè)定1.5麥?zhǔn)蠞舛葓缶?，?dāng)儀器達(dá)到1.5麥?zhǔn)蠞舛葓缶螅瑹o菌取出陽性培養(yǎng)液，分別置于2 個1.5 mL的無菌 EP 管約 1 mL，均 13 000 r/min 離心 2 min 制備沉淀物。2 份沉淀物分別進(jìn)行如下操作：1 份沉淀物MALDI?TOF 質(zhì)譜儀直接細(xì)菌鑒定，操作步驟見 1.3.3；另 1 份沉淀物 VITEK 2 Compact 儀器直接藥敏試驗，操作步驟見1.3.4。

1.3.2 常規(guī)方法 以上收集的141例血培養(yǎng)陽性樣本同時接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，35 ℃，5%CO2中培養(yǎng)24 h，待分離培養(yǎng)出單個菌落按照1.3.3和1.3.4進(jìn)行革蘭陽性球菌的鑒定和藥敏試驗。

1.3.3 MALDI?TOF 質(zhì)譜儀鑒定 將快速直接法的沉淀物吸取1μL涂抹于MALDI?TOF靶板上，常規(guī)方法挑取單個菌落均勻涂抹在MALDI?TOF靶板上，待上述2份樣本晾干后，在干燥的菌液上加入1μL 甲酸晾干后，再加入IVD HCCA 基質(zhì)溶液1μL，晾干后上機(jī)檢測，每一步試劑均仔細(xì)滴加覆蓋在每個樣本上。

1.3.4 VITEK 2 Compact 藥敏操作 將快速直接法的沉淀物吸取適量加入VITEK 2 Compact配套鹽水中，常規(guī)方法是用無菌拭子挑取單個菌落放入VITEK 2 Compact 配套鹽水中，以上分別調(diào)至0.5~0.63麥?zhǔn)蠞舛龋缓蟀凑諛?biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.4 鑒定和藥敏試驗判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 鑒定結(jié)果 依據(jù)MALDI?TOF 標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)菌鑒定分值大于等于2.000分，表示能有效鑒定至種；分值1.990~1.700 分之間，表示能有效鑒定至屬；分值低于1.700分，表示鑒定結(jié)果不可靠。

1.4.2 藥敏結(jié)果 VITEK 2 Compact 儀器藥敏結(jié)果參照CLSI M100?S29 文件標(biāo)準(zhǔn)報告為敏感（susceptible, S）、中介（intermediate, I）、耐藥（resistant,R）；快速直接方法與常規(guī)方法藥敏比較參照美國CLSI M23 ? A2 文 件[9]：分 類 一 致 性（categorical agreement, CA）指快速直接法與常規(guī)方法的符合率；一般錯誤（minor errors,MIE）指參考方法的結(jié)果為R 或S，實驗方法為I，或者參考方法的結(jié)果是I，實驗方法為S 或R；嚴(yán)重錯誤（major errors,ME）指參考方法的結(jié)果為S，實驗方法為R；極嚴(yán)重錯誤（very major errors,VME）指參考方法的結(jié)果是R,實驗方法為S；它們可接受的誤差范圍分別為CA ≥90%，MIE ≤ 10%，ME ≤ 3%，VME ≤ 1.5%。

l.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0軟件，率的比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 快速直接法鑒定率分析 快速直接法對革蘭陽性球菌的鑒定率為93.6%，其中不同菌屬鑒定率分別為葡萄球菌屬91.8%，腸球菌屬94.1%，鏈球菌屬100.0%，其中金黃色葡萄球菌、佩滕科夫葡萄球菌、路登葡萄球菌、里昂葡萄球菌、屎腸球菌、鏈球菌屬鑒定率為100.0%。快速直接法鑒定率與常規(guī)方法（>1.700）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表1。

表1 快速直接法革蘭陽性球菌鑒定率分析

2.2 快速直接法對葡萄球菌藥敏CA 和錯誤率分析 收集的141 例血培養(yǎng)革蘭陽性球菌陽性樣本，葡萄球菌屬85 株，占60.3%(85/141)，其中金黃色葡萄球菌16 株，占18.8%（16/85），凝固酶陰性葡萄球菌69 株，占81.2%（69/85）。金黃色葡萄球菌CA 為100.0%，無錯誤率；凝固酶陰性葡萄球菌藥敏CA均為90.0%以上，在環(huán)丙沙星、莫西沙星、利福平分別出現(xiàn)1例MIE（1.5%），均是3株表皮葡萄球菌；氯林霉素、四環(huán)素和紅霉素各出現(xiàn)1 例ME（1.5%），分別是1 株人葡萄球菌和2 株頭狀葡萄球菌，復(fù)方新諾明出現(xiàn)2 例ME（2.9%），分別是1 株人葡萄球菌和1 株溶血葡萄球菌；氯林霉素和復(fù)方新諾明各出現(xiàn)1例VME（1.5%），均是人葡萄球菌，表2。

表2 快速直接法對葡萄球菌藥敏的CA和錯誤率分析

2.3 快速直接法對腸球菌藥敏CA 和錯誤率分析34例血培養(yǎng)腸球菌陽性樣本中，屎腸球菌20株，占58.8%(20/34)，糞腸球菌14株，占41.2%（14/34）。腸球菌藥敏CA 均為90.0%以上，在ME 和VME 無錯誤率；在MIE 中屎腸球菌在紅霉素、呋喃妥因分別出現(xiàn)1 例錯誤，分別為5.0%；糞腸球菌MIE 在呋喃妥因出現(xiàn)1例錯誤，為7.1%，表3。

表3 快速直接法對腸球菌藥敏CA和錯誤率分析

2.4 快速直接法對鏈球菌藥敏CA 和錯誤率分析血培養(yǎng)陽性樣本分離出的12 例無乳鏈球菌，CA 為91.7%，僅在替加環(huán)素出現(xiàn)1 例MIE 錯誤，占8.3%，錯誤為常規(guī)方法I,快速方法R,未出現(xiàn)ME 和VEM錯誤，表4。

表4 快速直接檢測法對無乳球菌藥敏CA和錯誤率分析

2.5 快速直接法對頭孢西丁和誘導(dǎo)克林霉素耐藥分析 在85株葡萄球菌中，兩種方法共檢測到頭孢西丁67株陽性，16株為陰性，陰性一致率為100.0%（16/16），陽性一致率為97.1%(67/69)，總體一致率為97.6%（83/85），常規(guī)方法有2株檢測為陽性，但快速直接法為陰性。兩種方法誘導(dǎo)克林霉素耐藥32株陽性，47株陰性，陰性一致率為92.2%（47/51），陽性一致率為94.1%(32/34)，總體一致率為92.9%（79/85）。

3 討論

血流感染是臨床由病原菌侵入的一種嚴(yán)重感染癥狀，易引起高發(fā)病率和死亡率[10-12]，其中革蘭陽性球菌引起的感染為27.9%，金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌居主要分離病原菌的前5 位，對患者健康有一定影響[13]。血培養(yǎng)快速準(zhǔn)確的病原體鑒定和藥敏對膿毒癥患者非常重要，可大幅度降低膿毒癥的死亡率[10-12]。目前，血液中的病原菌是先培養(yǎng)后鑒定，陽性血培養(yǎng)中微生物鑒定的周期約為24~48 h，在此期間患者接受經(jīng)驗性抗菌藥物治療或不接受治療的時間較長。近年來，MALDI?TOF MS 已成為一種快速可靠的技術(shù)，可直接從陽性血培養(yǎng)物中快速鑒定病原菌，鑒定時間能夠縮短到10 h[14-21]，如果直接從血培養(yǎng)物中鑒定容易受到血細(xì)胞影響，從而降低準(zhǔn)確性。同時藥敏結(jié)果也不能立即獲得，導(dǎo)致患者接受廣譜抗菌藥物治療而不是靶向治療。有研究表明，靶向治療可以縮短患者住院時間，降低死亡率[22-23]。

基于激光散射技術(shù)的Alifax HB&L 微生物培養(yǎng)儀，使血培養(yǎng)陽性樣本培養(yǎng)時間縮短至2~3 h，本研究中快速直接法鑒定革蘭陽性球菌的鑒定率為93.6%，與常規(guī)方法一致但高于血清分離膠促凝管法82.3%[24]，不同菌屬鑒定率分別為葡萄球菌屬91.8%，腸球菌屬94.1%，鏈球菌屬100%，其中金黃色葡萄球菌、佩滕科夫葡萄球菌、里昂葡萄球菌、路登葡萄球菌、屎腸球菌、鏈球菌屬鑒定率為100%。表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、溶血葡萄球菌和糞腸球菌快速直接法鑒定率低，其原因可能由于MALDI?TOF MS 技術(shù)是檢測菌體獲得蛋白質(zhì)圖譜，但革蘭陽性菌細(xì)胞壁較厚，獲得的病原菌樣本蛋白質(zhì)圖譜與數(shù)據(jù)庫中圖譜存在差異，因此鑒定分值不高[25]。另有翟鑫[26]等用 MALDI?TOF MS 質(zhì)譜鑒定與核酸擴(kuò)增的基因進(jìn)行對比，結(jié)果對凝固酶陰性葡萄鑒定符合率為100%。85株革蘭陽性球菌快速直接法雖然有9株鑒定分值<1.700，但菌名鑒定均正確?？焖僦苯臃ㄔ诳s短血培養(yǎng)陽性樣本培養(yǎng)時間的基礎(chǔ)上，與常規(guī)方法在鑒定上具有較高的一致率，能夠為臨床快速確定患者血培養(yǎng)中為何種病原體感染提高臨床準(zhǔn)確判斷，有方向性針對用藥。

臨床革蘭陽性球菌引起的血流感染主要是金黃色葡萄球菌[27]，快速直接法檢測葡萄球菌藥敏顯示，金黃色葡萄球菌CA 為100%，并且無任何錯誤率；凝固酶陰性葡萄球菌常為血培養(yǎng)的污染菌，但其也可引起導(dǎo)管相關(guān)性血流感染和感染性心內(nèi)膜炎[28]，凝固酶陰性葡萄球菌CA 均為90.0%以上。在人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、頭葡萄球菌檢測氯林霉素、復(fù)方新諾明和紅霉素時均出現(xiàn)ME 和VME，雖然出現(xiàn)的錯誤率較高，但是在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，下一步應(yīng)該加大菌株和藥物的實驗進(jìn)行分析。本研究中腸球菌無ME 和VME，腸球菌的血流感染以屎腸球菌為主[13]，屎腸球菌在紅霉素和呋喃妥因各1例MIE，糞腸球菌在呋喃妥因1例MIE。無乳鏈球菌替加環(huán)素1例MIE。頭孢西丁和誘導(dǎo)克林霉素耐藥的檢測準(zhǔn)確性，影響臨床對葡萄球菌的用藥療效，檢測顯示頭孢西丁陰性和陽性一致率分別為100%和97.1%，誘導(dǎo)克林霉素耐藥陰性和陽性一致率分別為92.2%和94.1%。

快速直接法與常規(guī)方法比較，能夠達(dá)到很好的鑒定率和藥敏分類一致性，由于其準(zhǔn)確性高，總報告時間大大縮短，將有助于臨床快速直接鑒定血培養(yǎng)陽性樣本革蘭陽性球菌，指導(dǎo)用藥，提高患者生存率。