王翠翠, 陳安琪, 董文陽, 楊恒力, 王文卓, 朱 斌,史雪巖*,, 梁 沛, 劉豐茂, 束長龍, 張 杰

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，北京 100193；2. 中國農(nóng)業(yè)大學 理學院 應(yīng)用化學系農(nóng)藥創(chuàng)新中心，北京 100193；3. 中國農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193)

西蘭花Brassica oleraceavar.italica(broccoli)屬于十字花科頭狀花序蕓薹屬甘藍種中的一個變種，含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)[1]。小菜蛾P(guān)lutella xylostella(L.)，屬鱗翅目菜蛾科，以幼蟲為害白菜、蘿卜、甘藍、油菜等十字花科蔬菜[2]。在西蘭花生產(chǎn)中，小菜蛾、菜青蟲等鱗翅目害蟲的危害嚴重，目前主要以化學殺蟲劑防治為主，但化學殺蟲劑的廣泛應(yīng)用，導致害蟲產(chǎn)生抗藥性和農(nóng)產(chǎn)品出現(xiàn)農(nóng)藥殘留等問題。近年來，許多中國的蔬菜產(chǎn)品由于農(nóng)藥殘留超標而被限制出口至荷蘭、波蘭、英國、意大利和西班牙等歐盟國家。其中，西蘭花在受到出口制約的蔬菜產(chǎn)品中占比最大[3]，并且蟲螨腈殘留超標是導致西蘭花產(chǎn)品出口受阻的原因之一[4]。因此，蟲螨腈的殘留問題引發(fā)了關(guān)注。

蟲螨腈 (chlorfenapyr，圖式 1) 屬新型吡咯類化合物[5]，是一種殺蟲劑前體，在昆蟲體內(nèi)可經(jīng)過多功能氧化酶轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袣⑾x活性的化合物，通過抑制二磷酸腺苷 (ADP) 向三磷酸腺苷 (ATP) 轉(zhuǎn)化而發(fā)揮殺蟲作用[6]。蟲螨腈對多種害蟲具有胃毒和觸殺作用，被廣泛用于蔬菜害蟲的防治。有研究表明，使用蟲螨腈防治十字花科蔬菜甘藍、花椰菜等作物上的甜菜夜蛾、小菜蛾等害蟲效果顯著[7-8]。但因蟲螨腈是非極性化合物，具有水溶性差、在土壤中難降解及不易揮發(fā)等缺點，導致其在環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中的殘留問題較為突出，制約了西蘭花等蔬菜的出口[4,9]。

使用具有減量及增效作用的農(nóng)藥混配藥劑進行害蟲防治，對于減少農(nóng)藥污染，保障農(nóng)產(chǎn)品安全，提高經(jīng)濟、環(huán)境、生態(tài)效益，均十分有利[10]。蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis(Bt)是迄今研究最多、使用量最大的微生物農(nóng)藥[11]，對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等農(nóng)林害蟲均有較強的毒殺作用。但Bt 制劑在實際應(yīng)用中具有殺蟲速度相對較慢，生物活性易受外界環(huán)境 (溫度、光照等) 影響而導致持效期較短等缺點[12-13]。將化學農(nóng)藥與Bt 合理混配，對于克服化學農(nóng)藥和Bt 的缺點，實現(xiàn)減藥增效防治害蟲、降低農(nóng)殘的目的均十分有利。目前已有研究報道了Bt 與有機磷類、擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類等殺蟲劑混配后的增效作用，例如：李國清等[14]研究表明，Bt 與敵百蟲以不同比例混配后，對棉鈴蟲防治具有顯著增效作用，而不同比例的Bt 與氰戊菊酯混劑對棉鈴蟲防治的增效作用有所不同，有些混配劑顯示了增效作用，有些卻顯示了拮抗作用；王武剛[15]研究表明，在田間用Bt 預處理棉鈴蟲卵，可以使氰戊菊酯對棉鈴蟲幼蟲的田間防治效果提高60%～70%；張慧慧等[16]研究表明，Bt 和溴氰蟲酰胺分別以50%的推薦劑量按1 : 1 的質(zhì)量比混配，在藥后3 和7 d對小菜蛾的防效分別達90.70%和82.82%。目前，已有多種Bt 與化學殺蟲劑的復配制劑在中國登記使用。如Bt 與毒死蜱混配組成的可濕性粉劑被登記用于防治斜紋夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)，Bt 與高效氯氰菊酯組成的可濕性粉劑登記對象為十字花科蔬菜小菜蛾，Bt 與吡蟲啉組成的可濕性粉劑可兼治煙青蟲Helicoverpa assulta(Guenée) 和煙蚜Myzus persicae(Sulzer)，Bt 與氟鈴脲組成的可濕性粉劑登記對象為甘藍甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hubner) 等[17]。

目前，Bt 與蟲螨腈混配對小菜蛾的田間防效，以及西蘭花上蟲螨腈的殘留消解動態(tài)，尚未見研究報道。因此本研究以小菜蛾為研究對象，比較了蟲螨腈單劑、Bt 單劑、50%推薦劑量的蟲螨腈單劑、50%推薦劑量的Bt 單劑、50%推薦劑量的蟲螨腈與50%推薦劑量的Bt 混配使用對小菜蛾的田間防治效果，并研究了西蘭花上蟲螨腈的殘留消解動態(tài)，以期為Bt 與蟲螨腈混配進行小菜蛾等鱗翅目害蟲的防治，減少西蘭花上的蟲螨腈殘留提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試藥劑：蟲螨腈 (chlorfenapyr) 標準品(98.1%，上海市農(nóng)藥研究所有限公司)；10%蟲螨腈懸浮劑 (chlorfenapyr 10% SC)，法國巴斯夫歐洲公司；32 000 IU/mg 蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑(Bacillus thuringiensis32 000 IU/mg WP)，武漢科諾生物科技股份有限公司。

供試作物：西蘭花Brassica oleraceavar.italica品種為‘法斯特’ (天津科潤農(nóng)業(yè)科技有限公司)，于2019 年3 月24 日在北京市海淀區(qū)上莊鎮(zhèn)試驗田播種，采用大田小拱棚育苗，4 月11 日定植，雙行高垅栽培。

供試儀器：島津HPLC-MS 8050 高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 (島津有限公司)。

1.2 田間試驗設(shè)計

參照《農(nóng)藥田間藥效試驗準則》進行[18]。試驗共設(shè)7 個處理：1) 32 000 IU/mg 蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑 (Bt WP)，1 312.5 g/hm2(推薦劑量)；2) 32 000 IU/mg (Bt WP)，656.3 g/hm2(50%推薦劑量)；3) 10%蟲螨腈懸浮劑，622.5 mL/hm2(推薦劑量)；4) 10%蟲螨腈懸浮劑，311.3 mL/hm2(50%推薦劑量)；5) 32 000 IU/mg (Bt WP)，656.3 g/hm2(50% 推薦劑量)+ 10% 蟲螨腈懸浮劑，311.3 mL/hm2(50%推薦劑量)；6) 3 倍10%蟲螨腈懸浮劑，1 867.5 mL/hm2(300%推薦劑量)；7) 空白對照：施用等量清水。

每個處理3 次重復，每小區(qū)面積約15 m2，每小區(qū)30 株西蘭花，隨機排列。于小菜蛾發(fā)生盛期，用手動噴霧器施藥。各農(nóng)藥的使用劑量均采用其推薦劑量范圍的中間值。噴施清水為對照。

1.3 田間防效調(diào)查及其計算方法

采用等距取樣法調(diào)查，每小區(qū)等距離取3 個點，每點6 株，共18 株，分別于藥前調(diào)查蟲口基數(shù)，藥后1、3、7 d 及14 d 調(diào)查害蟲死亡情況，根據(jù)公式 (1) 和 (2) 計算蟲口減退率 (P) 和校正防效 (EC)。

式中，P為蟲口減退率，%；NCK為藥前活蟲數(shù)；Nt為藥后活蟲數(shù)；EC為校正防效，%；Pt為處理組蟲口減退率，%；PCK為對照組蟲口減退率，%。

1.4 西蘭花中蟲螨腈殘留檢測方法的建立

1.4.1 標準溶液的配制 準確稱取蟲螨腈標準品0.01 g (精確至0.1 mg) 于10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配成1 000 mg/L 的標準儲備溶液。分別用西蘭花花序提取液稀釋，配成1、0.5、0.1、0.05 和0.01 mg/L 的基質(zhì)匹配標準溶液。

1.4.2 樣品的提取與凈化 準確稱取1.0 g (精確至0.01 g) 冷凍粉碎的樣品于10 mL 離心管中，加入0.2 mL 水和3 mL 乙腈，渦旋提取2 min，加入0.5 g 氯化鈉，渦旋提取1 min 后，于4 000 r/min下離心1 min。取1.0 mL 提取液，加入50 mg C18凈化劑 (天津博納艾杰爾公司) 渦旋30 s，靜置后取上清液過0.22 μm 尼龍濾膜，待高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (HPLC-MS/MS) 檢測分析。可根據(jù)需要使用對應(yīng)的空白基質(zhì)液進行進樣前稀釋。

1.4.3 儀器檢測條件

色譜條件：Shim-pack GIST 色譜柱 (2.1 mm ×50 mm，1.8 μm，日本島津公司)；柱溫40 ℃；流動相為V(乙腈) :V(水) = 80 : 20，流速為0.2 mL/min；進樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源 (ESI)；離子源溫度300 ℃，脫溶劑化管DL 溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；霧化氣 (N2) 流速3 L/min；加熱氣 (N2)流速3 L/min；干燥氣 (N2) 流速10 L/min；毛細管電壓4 kV；掃描方式為負離子模式；多重反應(yīng)監(jiān)測模式 (MRM)。兩個離子對的m/z及碰撞能分別為346.95 ＞ 79.05(31 V) 及346.95 ＞ 131.15(37 V)，其中346.95 ＞ 79.05(31 V) 為定量離子對。

1.4.4 檢測方法的確證 在上述儀器條件下測定不同濃度基質(zhì)匹配標準溶液的色譜峰面積，以基質(zhì)匹配標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。此外，在西蘭花花序空白基質(zhì)中，分別添加5.0 和0.050 mg/kg 兩個水平的蟲螨腈標準溶液，每個水平5 個重復，按1.4.2 節(jié)的方法進行樣品前處理，用上述分析方法測定計算添加回收率及相對標準偏差 (RSD)，以考察所建方法的準確度和精密度。根據(jù)添加回收試驗，選擇最小添加濃度作為方法的定量限 (LOQ) 并驗證。

1.5 西蘭花田間采集樣品中蟲螨腈殘留的檢測

樣品采集及處理：分別于施藥后2 h 及1、3、5、7、10、14、21 d，采用5 點法取樣，每個采樣時間點采集兩個重復，每個重復由5 個西蘭花花序組成。對照僅采集施藥后2 h 及14、21 d的西蘭花樣品。

將采集的西蘭花花序樣品，切碎，混勻，四分法縮分留樣150 g 兩份，于 -20 ℃保存，待測。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析，用Waller-Duncan 法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種殺蟲劑不同處理對小菜蛾的田間防治效果

由表1 可以看出，Bt 按推薦劑量施藥后僅在藥后3 d 和7 d 對小菜蛾具有一定的防控作用，而按50%推薦劑量施藥后1～14 d 對小菜蛾的防效均低于40%，不能有效防控小菜蛾。蟲螨腈按推薦劑量施藥后1～7 d 內(nèi)對小菜蛾具有一定的防控作用，而按50%推薦劑量施藥后1～14 d 內(nèi)對小菜蛾均不具有防控作用。由此可見，Bt 和蟲螨腈單劑分別按推薦劑量施藥后7 d 內(nèi)對小菜蛾具有一定的防效，而按50%推薦劑量施藥后在14 d 供試期內(nèi)均不能對小菜蛾進行有效防控。

表1 兩種殺蟲劑不同處理對西蘭花上小菜蛾的田間防效Table 1 The field efficacy of the different treatments of two insecticides against Plutella xylostella on Brassica oleracea var. italica

50% 推薦劑量的蟲螨腈與50% 推薦劑量的Bt 混配使用，藥后1～7 d 對小菜蛾的防效與推薦劑量蟲螨腈單劑的防效間均無顯著差異，但均顯著超過了分別使用50%推薦劑量Bt 單劑及50%推薦劑量蟲螨腈單劑的防效。同時，在藥后3 d 也顯著超過了推薦劑量Bt 單劑的防效。在藥后14 d，各處理均不再具有防控作用，且均沒有顯著差異。因此，50%推薦劑量的Bt 與50%推薦劑量的蟲螨腈混配使用，在藥后1～7 d 對小菜蛾具有一定的防效，且具有一定的速效性和持效性。表明Bt與蟲螨腈合理混配可以達到減量使用蟲螨腈防控小菜蛾的目的，對于減少蟲螨腈的污染，降低害蟲抗藥性發(fā)展的風險具有價值。

2.2 西蘭花樣品中蟲螨腈殘留分析方法的建立

通常文獻報道的蟲螨腈殘留均使用氣相色譜-質(zhì)譜方法檢測[19-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，蟲螨腈經(jīng)電離源電離后，掉落基團[CH2OCH2CH3]后，產(chǎn)生的母離子m/z為346.95 [M-CH2OCH2CH3]-。將母離子進一步碰撞電離后產(chǎn)生的兩個子離子m/z分別為131.15 及79.05，因此可使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對蟲螨腈進行定性定量分析。在所建立的HPLC-MS/MS 的分析條件下，分別測定空白西蘭花花序樣品、添加蟲螨腈的西蘭花花序中蟲螨腈的殘留。結(jié)果表明：多重離子檢測條件對蟲螨腈的特異性較好，樣品基質(zhì)均不干擾蟲螨腈的檢測，蟲螨腈在西蘭花花序基質(zhì)中的線性相關(guān)性良好，標準曲線方程為y=123 300x+116.30，R2=0.998 0。LOQ 為0.050 mg/kg。在測定的濃度范圍內(nèi)，蟲螨腈在空白西蘭花花序基質(zhì)中的回收率在95%～109%之間，RSD 均 ≤ 10%。表明所建方法具有良好的準確性和重復性，滿足農(nóng)藥殘留測定要求[23]，可用于西蘭花花序的蟲螨腈殘留檢測。

澳大利亞和日本分別規(guī)定西蘭花上蟲螨腈的最大殘留限量 (MRL) 為0.50 mg/kg[24]和3.0 mg/kg[25]。歐盟規(guī)定蟲螨腈在西蘭花上的臨時限量為0.010 mg/kg[26]。我國規(guī)定蟲螨腈在結(jié)球甘藍上的MRL 值為1.0 mg/kg，在芥藍上為0.10 mg/kg，在黃瓜上為0.50 mg/kg，目前還沒有規(guī)定其在西蘭花上的MRL 值。因此，本研究中采用了澳大利亞規(guī)定的蟲螨腈在西蘭花上的MRL 值0.50 mg/kg來評價其殘留水平，但由于不同地區(qū)施藥方式、膳食及消費等差異，其合理性有待商榷。

研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同劑量的蟲螨腈處理后，蟲螨腈在西蘭花上的殘留消解動態(tài)有所不同，但均符合準一級反應(yīng)動力學或一級反應(yīng)動力學方程。推薦劑量的蟲螨腈施藥7 d 后，其在西蘭花上的消解率為72%，殘留量為0.14 mg/kg，已低于其在西蘭花上的MRL 值 (0.50 mg/kg)，21 d 時已低于LOQ (0.050 mg/kg)。

按50% 的推薦劑量施用蟲螨腈單劑或混配施用后7 d，蟲螨腈在西蘭花上的殘留量 (分別為0.083 mg/kg 和0.072 mg/kg) 已遠低于蟲螨腈在西蘭花上的MRL 值，14 d 時已低于LOQ (0.050 mg/kg)。表明減量施用蟲螨腈單劑及其與Bt 混配制劑，均可降低蟲螨腈在西蘭花上的殘留風險。因此，可將減量50% 的蟲螨腈與減量50% 的Bt 混配使用，既可以有效防治小菜蛾，又可以解決西蘭花上蟲螨腈殘留超標的問題。

此外，為了研究超量使用蟲螨腈對西蘭花的殘留風險，研究了按3 倍推薦劑量施用蟲螨腈后對小菜蛾的防效及蟲螨腈的殘留消解動態(tài)。結(jié)果(表1 及表2) 表明，雖然3 倍劑量蟲螨腈對小菜蛾的防效較好，但其殘留消解速率顯著減慢。施藥后14 d 的殘留量為0.27 mg/kg，明顯高于其他處理的殘留量?？梢?，農(nóng)藥過量使用會增加農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留超標風險。

表2 蟲螨腈在西蘭花中的殘留消解動態(tài)Table 2 Residue dissipation dynamics of chlorfenapyr in Brassica oleracea var. italica

3 結(jié)論與討論

小菜蛾作為蔬菜上的重要害蟲，隨著化學殺蟲劑的大量使用，小菜蛾抗藥性問題日益突出，對其防治的難度越來越大，同時會增加農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和環(huán)境安全風險。因此，篩選安全高效的防治藥劑與組合配方對小菜蛾防治和農(nóng)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)具有重要意義。

將Bt 與化學農(nóng)藥混配進行害蟲防治，可以有效減少化學殺蟲劑的使用量，從而減少農(nóng)藥殘留對農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的污染，并延緩害蟲抗藥性的發(fā)展。Bt 與殺蟲劑混配對害蟲的防治作用已有很多研究報道。李玉奎等[27]研究表明，滅多威與Bt 混配對棉鈴蟲防治的持效期比滅多威單劑延長了3～5 d。付建紅等[28]研究表明，Bt 與高效氯氰菊酯復配對棉鈴蟲的防治效果比兩個單劑的累加防效高16.6%。姚經(jīng)武[29]報道0.80%Bt 粉劑與減量80%的毒死蜱混配的可濕性粉劑，對斜紋夜蛾2 齡幼蟲的共毒系數(shù)為184，具有明顯的增效作用。宋健等[30]研究表明，Bt 與減量的噻蟲胺、呋蟲胺和蟲螨腈分別混用，不僅殺蟲速效性好，而且殺蟲毒力均大幅提高，對韭蛆的防效表現(xiàn)出了明顯的增效作用。本研究結(jié)果表明，50%推薦劑量蟲螨腈與50%推薦劑量Bt 混配施用后，7 d 內(nèi)的防效與推薦劑量的蟲螨腈防效沒有差異，但均顯著超過了施用相同劑量的蟲螨腈與Bt 單劑的防效，且在藥后1 d 和3 d 均顯著超過了施用推薦劑量Bt 單劑的防效。表明50%推薦劑量的蟲螨腈與50%推薦劑量的Bt 混配使用具有減量增效的作用。

本研究中，減量50% 的蟲螨腈和減量50%的Bt 混配施用，在藥后1～7 d 對小菜蛾的防效較好，具有一定的速效性和持效性，這可能與化學農(nóng)藥和生物農(nóng)藥混配后仍然能夠較好發(fā)揮各自的殺蟲作用且殺蟲活性作用能夠互補有關(guān)。此外，有文獻報道，小菜蛾對化學殺蟲劑和Bt 殺蟲蛋白沒有交互抗性，且與Bt 混配可以延緩對化學殺蟲劑抗藥性的發(fā)展[31-32]，因此，將Bt 與蟲螨腈減量混配使用，對小菜蛾的抗性治理可能會具有一定的作用，但還需進一步研究證實。

本研究中，雖然各蟲螨腈處理對西蘭花上小菜蛾都具有一定的防效，但是防效均介于40%～70%之間，并不是非常高。這一方面可能是由于試驗區(qū)內(nèi)小菜蛾對蟲螨腈產(chǎn)生了一定程度的抗藥性，另一方面可能與西蘭花的表面蠟質(zhì)較厚，而本研究使用的是對環(huán)境相對友好的蟲螨腈懸浮劑，因而可能導致藥劑對西蘭花的穿透性較差有關(guān)。張衛(wèi)飛等[33]也報道施藥后7 d 內(nèi)蟲螨腈對花椰菜上小菜蛾的防效低于60%。此外，蟲螨腈和Bt 的混配比例也有可能影響對小菜蛾的防治效果，由于試驗條件限制，本研究僅進行了蟲螨腈與Bt 分別按50%推薦劑量混配的試驗，對于其他混配比例是否存在較高防效尚待研究。因此，對于蟲螨腈在西蘭花上小菜蛾防治中藥效不是十分突出的原因，還需進一步的探究。

有研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥劑型、用量等均會影響農(nóng)藥的殘留及消解動態(tài)[34-35]。因此，明確蟲螨腈在西蘭花上的殘留消解動態(tài)，可以為蟲螨腈的安全使用及西蘭花的安全生產(chǎn)提供科學依據(jù)。本研究表明，推薦劑量蟲螨腈在西蘭花上的半衰期為4.1 d，50%推薦劑量蟲螨腈的半衰期為3.8 d，50%推薦劑量蟲螨腈與Bt 混配劑的半衰期為4.2 d。這與文獻報道的蟲螨腈在青菜中的半衰期為4.3 d，在小白菜中半衰期為2.7～10.6 d一致[36-37]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，蟲螨腈與Bt 分別減量50%后混配使用并未顯著影響蟲螨腈在西蘭花上的殘留消解動態(tài)，但有效降低了蟲螨腈在西蘭花上的原始沉積量，且隨著時間的延長，殘留量也顯著降低。這與阿維菌素、乙霉威和腐霉利在黃瓜上的研究結(jié)果一致[34-35]。因此，蟲螨腈與Bt 通過減量混配使用，可以達到減量增效、降低西蘭花上蟲螨腈殘留的目的。

綜上，蟲螨腈與Bt 合理混配用于防治西蘭花上的小菜蛾，不僅可以減少蟲螨腈的用量，降低其殘留，減緩害蟲的抗藥性發(fā)展，還可以彌補生物農(nóng)藥制劑Bt 藥效發(fā)揮受環(huán)境影響大的缺點，從而達到減藥防治小菜蛾、實現(xiàn)西蘭花安全生產(chǎn)的目的，具有一定的應(yīng)用前景。