柏 玲,陳 晨

工作壓力的增大、環(huán)境有害物質(zhì)的增加等多種因素作用，使女性卵巢功能損傷、生育能力下降的問題逐漸顯現(xiàn)，亟待解決[1]。顆粒細(xì)胞是卵泡發(fā)育和閉鎖過程中最重要的參與細(xì)胞,通過與卵泡膜相互作用以維持正常的卵巢功能[2]。研究中我們發(fā)現(xiàn)miR-223在卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)，文獻(xiàn)資料顯示miR-223與IGF-1R基因存在靶向調(diào)控作用[3]，目前尚無(wú)miR-223通過靶向下調(diào)IGF1R-AKT/mTOR通路對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖及其凋亡產(chǎn)生影響的文獻(xiàn)資料報(bào)道，為進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè)，我們?cè)O(shè)計(jì)了本次研究，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本研究于2019年6月-2019年12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，人卵巢顆粒細(xì)胞購(gòu)自ATCC公司，miR-223慢病毒購(gòu)自VectorBuilder公司，蛋白抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(IGF1R兔抗人抗體，bs-4985R；p-S6K1兔抗人抗體，bs-5669R；p-4EBP1，bs-14550R;山羊抗兔二抗，bs-0295G-HRP)。實(shí)驗(yàn)依據(jù)細(xì)胞處理方式分為以下3組：①正常對(duì)照組為細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)；②慢病毒對(duì)照治療組為正常對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照慢病毒；③miR-223 Mimics組(Mimics組)為正常對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-223 Mimics慢病毒，各組細(xì)胞于慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每組3個(gè)重復(fù)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)：SVOG細(xì)胞培養(yǎng)液為1 640培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1%雙抗。培養(yǎng)條件：37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，95%空氣+5%二氧化碳。細(xì)胞融合80%左右按1∶3進(jìn)行傳代。

1.3 CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)：采用0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后將上述各組細(xì)胞分別接種于96孔板中，每空104個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)重復(fù)。接種后0、24、48 h加入100 μl含10% CCK8工作液的完全培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育2h后，取出96孔板，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞OD值。

1.4 Western Blot檢測(cè)：采用0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，參照全蛋白提取試劑盒(凱基KGP250)操作流程提取各組細(xì)胞蛋白，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(凱基KGPBCA)檢測(cè)蛋白濃度，配置SDS凝膠，每組蛋白上樣量30 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜，3% BAS封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜(IGF1R,1∶1 000；p-S6K1,1∶1 000；p-4EBP1,1∶1 000)。第2天洗膜，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，再洗膜，ECL發(fā)光檢測(cè)，蛋白表達(dá)檢測(cè)采用ImageJ軟件檢測(cè)條帶灰度值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)：0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每組分別取106個(gè)細(xì)胞，75%乙醇固定過夜，PBS溶液離心洗滌3次(800 g，5 min)，采用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(凱基KGA511)配置PI/RNase A 染色工作液，每個(gè)樣本加入500工作液，4 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，每組3個(gè)重復(fù)。

1.6 Q-PCR檢測(cè)：0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，參照Trizol總RNA提取試劑(凱基KGA1203)操作說明提取各組細(xì)胞RNA，檢測(cè)RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄，采用ABI 7500熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。各基因PCR用2-△△CT計(jì)算各基因RNA的相對(duì)表達(dá)量，見表1。

表1 各基因Q-PCR序列信息

2 結(jié)果

2.1 人卵巢顆粒慢病毒轉(zhuǎn)染效果：慢病毒轉(zhuǎn)染后Q-PCR檢測(cè)，miR-223表達(dá)量正常對(duì)照為(1.00±0.091)，慢病毒對(duì)照組為(0.997±0.123)倍，Mimics組為(3.857±0.215)倍，Mimics組miR-223表達(dá)顯著上調(diào)(F=351.87，P<0.05)，Mimics組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè):CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示,Mimics細(xì)胞24、48 h OD值與正常對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t24=14.86，t48=27.26，P<0.05),見表2。

表2 各組細(xì)胞CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)比較

2.3 各組細(xì)胞周期分析：流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，Mimics組細(xì)胞與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中Mimics組G1期細(xì)胞比例高于對(duì)照組，S期、G2期細(xì)胞比例低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tG1=15.09，tS=6.39，tG2=28.88，P<0.05)，見表3。

表3 各組細(xì)胞周期分布比較

2.4 各組細(xì)胞凋亡檢測(cè):流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，Mimics組細(xì)胞凋亡率高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.45，P<0.05)，見表4。

表4 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.5 IGF1R-AKT/mTOR通路基因Western-Blot、Q-PCR檢測(cè)：IGF1R-AKT/mTOR通路基因Western-Blot、Q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示Mimics組IGF1R基因mRNA、蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tmRNA=36.93，t蛋白=11.16，P<0.05),且p-S6K1、p-4EBP1蛋白含量較正常對(duì)照組減少(tp-S6K1=10.55，tp-4EBP1=9.55，P<0.05)，見圖1(目錄后)。

3 討論

生殖衰老是困擾現(xiàn)代女性的一大問題,女性生育力隨著年齡增長(zhǎng)逐漸下降,在30歲后尤為顯著,在35～40歲下降加速,至45歲幾乎降為零[4]。卵巢功能及其微環(huán)境穩(wěn)態(tài)與女性生殖衰老息息相關(guān),卵巢顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)分化恰恰是卵泡的主要構(gòu)成成分，顆粒細(xì)胞表面包含大量受體且能夠分泌雌激素、孕激素等多種具有生物活性的激素，進(jìn)而促進(jìn)原始卵泡啟動(dòng)、生長(zhǎng)為成熟卵泡[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，卵巢顆粒細(xì)胞的異常凋亡或是其基因表達(dá)異常，與多囊卵巢綜合征患者卵泡發(fā)育障礙及雄激素水平異常及卵巢早衰密切相關(guān)[6]，為此卵泡中顆粒細(xì)胞數(shù)量及其功能對(duì)女性生殖功能具有重要影響[7]。

miRNA為人體內(nèi)相對(duì)保守的內(nèi)源性非編碼RNA,其參與調(diào)控基因組中半數(shù)以上功能基因的表達(dá)，miRNA通過與靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的3’-UTR結(jié)合,引起靶mRNA的降解進(jìn)而阻礙靶基因翻譯，腫瘤學(xué)研究表明miRNA參與所有惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程[8]。胰島素樣生長(zhǎng)因子1 (IGF-1R) 是一種多肽類生長(zhǎng)因子,IGF-1R在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等多種生命活動(dòng)中扮演著重要角色[9]。相關(guān)研究表明，IGF1R所含的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域可以激活下游的PI3K/AKT/mTOR通路，該通路通過促進(jìn)其下游底物S6K1蛋白和4EBP1蛋白磷酸化,進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成,促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和抑制細(xì)胞凋亡[10-11]。

本次研究發(fā)現(xiàn)人卵巢顆粒細(xì)胞中上調(diào)miR-223表達(dá)，顆粒細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，同時(shí)顆粒細(xì)胞凋亡率增加，Western-Blot、Q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示上調(diào)miR-223表達(dá)，IGF1R基因mRNA、蛋白表達(dá)均下調(diào)，同時(shí)mTOR通路下游p-S6K1、p-4EBP1蛋白含量減少，說明IGF1R-AKT/mTOR通路活性被抑制。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了miR-223通過靶向下調(diào)IGF1R基因表達(dá)進(jìn)而下調(diào)AKT/mTOR信號(hào)通路抑制卵巢顆粒細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡。研究為卵巢顆粒細(xì)胞損傷的相關(guān)機(jī)制研究提供了新的思路。