蔣 雁，張居清，朱亞俊，于 婷，楊婷婷,*

1.貴州省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站 (貴陽 550001)2.盱眙金谷糧食集團(tuán)有限公司 (盱眙 211700)3.江蘇省蘇微微生物研究有限公司 (無錫 214063)

隨著我國工業(yè)的飛速發(fā)展，工業(yè)“三廢”、糧食種植過程中大量農(nóng)藥、化肥的使用以及糧食的的生產(chǎn)加工過程，都會直接或間接地對糧食帶來重金屬污染，從而對糧食質(zhì)量安全也造成嚴(yán)重的危害。糧食中重金屬鉛的污染主要存在于玉米、小麥及水稻中。長期食用被鉛污染的糧食，造成人體內(nèi)重金屬鉛的富集，對神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼造血機(jī)能、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等均有危害。特別是大腦處于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育敏感期的兒童，很容易造成兒童發(fā)育遲緩等不良后果[1-2]。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017中關(guān)于谷物中鉛的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.2 mg/kg。但是糧食谷物中鉛超標(biāo)的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因此研究糧食谷物中鉛的檢測方法意義重大。

重金屬鉛的常規(guī)檢測方法[3-8]檢出限低、準(zhǔn)確度高，但是設(shè)備昂貴，前處理繁瑣耗時(shí)，試樣需進(jìn)行消解，對人員素質(zhì)要求較高，不能滿足基層檢測單位現(xiàn)場快速檢測的要求。因此，迫切需要建立一種快速、方便、準(zhǔn)確和低成本的可實(shí)現(xiàn)批量樣本快速篩查的檢測方法，從而滿足糧食收購過程監(jiān)控、現(xiàn)場監(jiān)督、檢查的工作需要。免疫分析法與上述幾種分析方法相比具有操作簡便、特異性好、分析檢測成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，目前已報(bào)道的免疫分析方法大多采用膠體金試紙條或者ELISA法[9-10]。本研究室前期已開發(fā)了重金屬鎘的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測卡，該方法檢測谷物中的重金屬鎘，樣品前處理簡單、快速，與傳統(tǒng)儀器法測定相比安全系數(shù)較高。在此基礎(chǔ)上，再次開發(fā)重金屬鉛的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測卡，用于糧食谷物中鉛的快速定量測定。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

SW-2型時(shí)間分辨熒光檢測儀，江蘇省蘇微微生物研究有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HS-3型垂直混勻儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；JP-100T型超聲機(jī)，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；BPG-9240A型精密鼓風(fēng)干燥箱，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；HM3035型三維劃膜噴金儀，CTS300型數(shù)控裁條機(jī)，ZQ2000型自動斬切機(jī)，上海金標(biāo)生物科技有限公司。

1.2 試劑與材料

碳二亞胺(EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)，Sigma-Aldrich公司；乙二胺四乙酸(EDTA)，上海百靈威公司；Pb-EDTA-BSA偶聯(lián)物、抗Pb-EDTA單抗，本研究室自研；羊抗鼠IgG，上海杰一生物有限公司；銪Eu3+納米微球，平均粒徑200 nm，長沙美牛生物科技有限公司；硝酸纖維素膜CN140，德國賽多利斯；樣品墊，SB08，上海金標(biāo)生物科技有限公司；吸水紙，SX27，上海金標(biāo)生物科技有限公司；PVC底板，SM31-25，上海金標(biāo)生物科技有限公司；重金屬鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)100377糙米粉、(GBW(E)100379全麥粉，北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院；其他樣品由江蘇省糧油質(zhì)量檢測中心提供(通過ICP-MS定值)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1抗Pb-EDTA單抗的熒光納米微球標(biāo)記

將銪Eu3+納米微球超聲分散10 min后，取出100 μL于2 mL 圓底離心管中，加入900 μL超純水混勻，并超聲分散5 min。分別配制50 mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)與碳二亞胺(EDC)的乙醇溶液，各取50 μL加入上述混合液中，混勻后于垂直混勻儀上室溫旋轉(zhuǎn)混勻40 min，15 000 r/min離心20 min，去除上清液，加入1 mL超純水，超聲5 min使微球分散。于活化后的微球懸液中加入0.05 mg抗Pb-EDTA單抗，置于垂直混勻儀上室溫反應(yīng)2 h，加入BSA使之最終濃度為0.5%，封閉1 h，15 000 r/min離心20 min，去除上清液，加入1 mL復(fù)溶液超聲分散后2 ℃～8 ℃冷藏備用。

1.3.2熒光免疫試紙條的組裝

通過實(shí)驗(yàn)條件篩選，確定最佳包被抗原、羊抗鼠IgG的工作濃度以及熒光抗體的工作濃度。用三維劃膜噴金儀將包被抗原和羊抗鼠IgG分別包被于NC膜上，形成檢測線(T)和質(zhì)控線(C)。將一定濃度的熒光標(biāo)記抗體噴涂于結(jié)合墊上，上述NC膜和結(jié)合墊于45 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h以上。以PVC膠粘板作襯板，將層析膜粘貼在襯板的中央。將樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙分別粘貼在層析膜的兩端，并且兩墊之間有1～2 mm的交聯(lián)。將組裝好的試紙條大板用自動斬切機(jī)切割成寬4 mm、長60 mm的板條，裝于塑料卡殼中，用壓殼機(jī)壓緊。放入帶干燥劑的鋁箔袋中，連續(xù)封口機(jī)封口后，常溫保存。

1.3.3檢測原理

重金屬Pb時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測卡應(yīng)用競爭抑制免疫層析的原理，樣本中若含有重金屬Pb，會先與樣品稀釋液中的EDTA形成螯合物(即Pb-EDTA)，在側(cè)向移動的過程中會與熒光微球標(biāo)記的特異性單克隆抗體反應(yīng)，從而抑制抗體和NC膜檢測線(T)上的抗原(Pb-EDTA-BSA偶聯(lián)物)的結(jié)合。隨著樣本中Pb含量的升高，結(jié)合于檢測線上的抗體量減少，相應(yīng)的檢測線熒光強(qiáng)度也隨之變?nèi)?。使用專用時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測儀讀數(shù)，可定量的測出樣本中Pb的含量。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配制0.01 mol/L的pH為7.2的磷酸鹽緩沖液，加入0.5%的吐溫-20和1 mg/L的EDTA，以此作為樣品稀釋液，將Pb標(biāo)準(zhǔn)品1 000 μg/mL 用上述樣品稀釋液定容配制成1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液；再逐步稀釋成濃度分別為0、1、2、4、8、16 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別取100 μL加至試紙條的樣品孔中，室溫(25 ℃±5 ℃)下反應(yīng)10 min，由低濃度到高濃度進(jìn)行檢測，采用時(shí)間分辨熒光儀檢測T線與C線熒光強(qiáng)度，計(jì)算T/C值。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的自然對數(shù)值(lnC)為橫坐標(biāo)，各濃度標(biāo)準(zhǔn)液的T/C值與0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液的T0/C0值的比值所得百分比為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5樣品前處理

準(zhǔn)確稱1.0 g粉碎均勻樣本至15 mL離心管中，量取5 mL 1 mol/L的稀硝酸溶液，至漩渦混勻器上渦旋提取3 min，于離心機(jī)中4 000 r/min離心5min，得上清液。移取100 μL上清液于1.5mL離心管中，加入200 μL 0.5 mol/L 的NaOH溶液，至漩渦混勻器上渦旋混勻，吸取100 μL上述混勻液于1.5 mL離心管中，再加入400 μL樣品稀釋液至其中，至漩渦混勻器上渦旋混勻，1 min內(nèi)待檢。

1.3.6方法的技術(shù)參數(shù)

(1)靈敏度

(2)檢出限與定量限

(3)準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度依據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)定值的檢測偏差判定，用正確度表示。采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別根據(jù)步驟1.3.5和1.3.4進(jìn)行處理和檢測，平行測定不低于6次。根據(jù)時(shí)間分辨熒光分析儀測得的T/C值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出檢測濃度，按公式(1)計(jì)算準(zhǔn)確度：

正確率=檢測均值/樣本標(biāo)定值×100%

(1)

(4)精密度

精密度依據(jù)批內(nèi)精密度，指同一批次產(chǎn)品檢測同一樣本結(jié)果的重復(fù)性，用變異系數(shù)(CV)表示，根據(jù)公式(2)計(jì)算。采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具體步驟同1.3.6中準(zhǔn)確度測定的(3)方法。根據(jù)所得測定結(jié)果，計(jì)算變異系數(shù)(CV值)。

變異系數(shù)(CV)=標(biāo)準(zhǔn)差/檢測均值×100%

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1為建立的重金屬Pb的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從中可看出，在1～16 ng/mL濃度范圍內(nèi)，有效劑量值即抑制率在93.2%～37.3%，線性回歸相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.996 9，直線方程y=-0.221 1x+0.922 7。由此，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，并以此作為以下試驗(yàn)的線性濃度。

圖1 重金屬Pb的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的技術(shù)參數(shù)

2.2.1靈敏度

表1 重金屬Pb靈敏度的測定

2.2.2檢出限與定量限

通過測定20份陰性稻谷樣本，通過計(jì)算得出該方法的檢出限為8.70 μg/kg，定量限為22.39 μg/kg，具體測定結(jié)果見表2。

2.2.3準(zhǔn)確度

采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照步驟檢測，測定結(jié)果如表3所示，可見回收率在93.2%～104%之間，變異系數(shù)(CV)均在15%以下。

表3 重金屬Pb準(zhǔn)確度的測定(n=6)

2.2.4精密度

采用同一批次層析卡，分別測定高、中、低三個濃度的重金屬Pb標(biāo)準(zhǔn)品，通過測定值計(jì)算得出的變異系數(shù)在3.6%～6.2%之間，說明精密度良好。

表4 重金屬Pb精密度的測定(n=10)

3 結(jié)論

本研究在前期重金屬鎘的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測卡研究基礎(chǔ)上，開發(fā)了重金屬鉛的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測，與傳統(tǒng)儀器法測定相比，該檢測方法樣品前處理簡單、快速，操作安全性更高。對所建立的方法進(jìn)行了一系列參數(shù)優(yōu)化，該方法的檢出限和定量限分別為8.70 μg/kg和22.39 μg/kg，對有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測回收率在93.2%～104%之間。

所建立的時(shí)間分辨免疫熒光試紙條操作簡單，樣本處理過程只需稀酸簡單提取和稀釋后即可測定，整個操作過程大約需要20 min，配套小型經(jīng)濟(jì)、便攜的熒光分析儀，非常適合基層單位，便于大量樣本的快速初步篩查，從而滿足糧食收購過程監(jiān)控、現(xiàn)場監(jiān)督、檢查的工作需要。