羊文偉 壽松濤

（1.杭州市富陽(yáng)區(qū)銀湖街道區(qū)域發(fā)展與治理中心，杭州 311400；2.杭州市富陽(yáng)區(qū)鄉(xiāng)村振興服務(wù)中心，杭州 311400）

茶樹(shù)是異花授粉植物，長(zhǎng)期異花授粉使其形成高度雜合的遺傳特性，以至于同一株茶樹(shù)的種子后代也產(chǎn)生嚴(yán)重的性狀分離。這種遺傳分離，使有性系品種快速退化，給茶樹(shù)有性系品種的培育和推廣帶來(lái)了困難。然而，這種遺傳分離，也為無(wú)性系茶樹(shù)品種的選育提供了廣泛的選擇機(jī)會(huì)?，F(xiàn)有關(guān)于茶樹(shù)有性后代的性狀分離的研究，多停留在性狀的綜合描述，而對(duì)群體內(nèi)化學(xué)成分分離的測(cè)試數(shù)據(jù)卻不多。為此，本研究測(cè)定了‘鳩坑種’種子后代群體茶葉兒茶素類(lèi)和咖啡堿含量的分離變異，為優(yōu)良無(wú)性系選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

本研究所用的試劑主要有：甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸（色譜純），咖啡堿（CAFF，≥98%）、兒茶素（C，≥98%）、沒(méi)食子酸（GA，≥98%）、表兒茶素（EC≥98%）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC，≥98%）、沒(méi)食子兒茶素（GC，≥98%），兒茶素沒(méi)食子酸酯（CG，≥98%）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG，≥98%）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG，≥98%）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（GCG，≥98%）（均購(gòu)于阿拉丁試劑（上海）有限公司）。乙醇、乙腈和乙酸購(gòu)于國(guó)藥試劑集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（中國(guó)上海），均為色譜純；試驗(yàn)用水均為實(shí)驗(yàn)室自制ddH2O。

本研究所用的試驗(yàn)儀器有：HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市杰瑞爾有限公司），AB265-S分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司），賽默飛Sorvall Legend Micro 17R離心機(jī)（上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司），KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），超純水儀（賽默飛世爾科技公司，上海市浦東新區(qū)），LC-20 AD高效液相色譜儀（日本島津公司，日本京都）。

1.2 植物材料

本研究所用的茶樹(shù)材料為‘鳩坑種’茶樹(shù)品種1個(gè)植株上采集的種子培育的3年生茶樹(shù)單株20株，于2020年4月10日采集一芽二葉新梢，每個(gè)單株采集100～150 g，以同時(shí)期采摘的‘鳩坑種’新梢為對(duì)照；采下的鮮葉直接用蒸汽殺青1分鐘，（80.0±1.0）℃烘干至含水量約5%，粉碎并過(guò)16目篩，包裝于鋁塑符合自封袋，保存于（4.0±1.0）℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 含水量測(cè)定 參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“GBT 8304－2013茶水分測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)”中120℃快速烘干法測(cè)定茶葉含水量。干凈帶蓋鋁盒于（103±2）℃烘干1 h，取出并放入干燥盒冷卻至室溫，然后稱重（Mp）；再稱取茶葉樣品4 g（M1）置于干燥鋁盒中，開(kāi)蓋，在120℃烘干1 h，蓋上蓋子，取出放如干燥器快速冷卻至室溫，第二次稱重（M2）。按照以下公式計(jì)算樣品含水量：水分（%）＝100*［（Mp＋M1）－M2］／M1。

1.3.2 樣品萃取 稱取0.15 g磨碎備測(cè)的茶葉樣品，放入50 mL離心管，加入25 mL濃度為50%生物遺傳，于70℃水浴浸提20 min，浸提中每隔5 min將樣品搖動(dòng)1次，浸提完成后取出冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，在5 000 rpm離心10 min，吸取上清液待測(cè)。

1.3.3 兒茶素類(lèi)和生物堿測(cè)定 用HPLC法檢測(cè)兒茶素類(lèi)和生物堿含量。HPLC條件：色譜柱為安捷倫TC 4.6 mm×250 mm C18，柱溫35℃；流動(dòng)相A是比例為3∶0.5∶96.5的乙腈／乙酸／水混合液；流動(dòng)相B為30∶0.5∶69.5的乙腈／乙酸／水混合液；流速1 mL／min；線性梯度洗脫：流動(dòng)相B在35 min內(nèi)從20%提高到65%；進(jìn)樣量10μL；測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。根據(jù)兒茶素類(lèi)和生物堿標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間以及峰面積對(duì)被測(cè)樣品的標(biāo)的物分別進(jìn)行定性和定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉兒茶素類(lèi)含量

表1顯示，‘鳩坑種’種子后代20個(gè)單株的兒茶素類(lèi)化合物含量存在明顯差異，兒茶素類(lèi)總含量變異范圍在185.69±0.18 mg／g（第8株）到286.32±6.34 mg／g（第12株），后者為前者的1.54倍。對(duì)照的兒茶素類(lèi)總含量（236.32±9.99 mg／g）居于兩者之間。與對(duì)照相比，兒茶素類(lèi)總含量最低者是對(duì)照的78.58%，而含量最高者為對(duì)照的121.16%。按照兒茶素類(lèi)總含量為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)含量的株數(shù)為縱坐標(biāo)作圖顯示，兒茶素類(lèi)總含量的分布基本呈現(xiàn)正態(tài)分布（圖1）。

圖1 兒茶素類(lèi)總含量分布

（－）-表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）是茶葉最主要的兒茶素類(lèi)化合物。表1顯示，第20號(hào)單株（68.78±1.25 mg／g）含量最低，第13號(hào)單株（140.75±5.31 mg／g）含量最高，后者為前者的2.05倍。按照含量水平不同的株數(shù)分布圖也呈現(xiàn)正態(tài)分布（圖2）。該結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)雜交或者有性后代的性狀分離群體，有可能篩選出高EGCG的單株。

圖2 EGCG含量分布圖

2.2 咖啡堿含量

咖啡堿是茶葉重要品質(zhì)成分和功能物質(zhì)，‘鳩坑種’后代咖啡堿含量也產(chǎn)生明顯分離現(xiàn)象（表1）。含量分布范圍是從30.66±1.16 mg／g（第18株）至43.34±1.71 mg／g（第15株），分別為對(duì)照（38.63±0.45 mg／g）的79.37%和112.19%。含量分布也呈現(xiàn)正態(tài)分布現(xiàn)象（圖3）。

表1 高EGCG茶樹(shù)品系初步篩選（mg／g）

圖3 咖啡堿含量分布圖

根據(jù)各種成分在各株之間分布的變異系數(shù)判斷，咖啡堿含量的變異系數(shù)最?。?.94%），而（＋）-兒茶素沒(méi)食子酸酯（CG）的變異系數(shù)最大，達(dá)到253.96%；其它成分的變異系數(shù)介于咖啡堿和CG之間（表1）。兒茶素類(lèi)總含量和EGCG含量的變異系數(shù)分別為15.39%和29.30%。種子繁殖后代咖啡堿含量的變異系數(shù)小，說(shuō)明：欲從種子繁殖后代和雜交手段培育咖啡堿含量超低的株系可能性較小。