方求武，高 雄，孫曼曼，劉秀霞，李 業(yè)，楊艷坤，白仲虎

(1.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122;3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122)

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，廣泛用于氨基酸發(fā)酵，如谷氨酸[1]和賴氨酸[2]的生產(chǎn)。近年來(lái)，由于其易于分泌目標(biāo)蛋白[3]，細(xì)胞外水解酶活低和無(wú)內(nèi)毒素[4]等特性，已發(fā)展成為表達(dá)外源蛋白的理想宿主[5]。然而，高強(qiáng)度表達(dá)載體的缺乏限制了谷氨酸棒狀桿菌的應(yīng)用。因此，探索和開(kāi)發(fā)一些具有高表達(dá)能力的載體具有重要意義，也在一定程度上促進(jìn)谷氨酸棒桿菌的商業(yè)應(yīng)用。

通過(guò)篩選具有高表達(dá)能力的啟動(dòng)子和優(yōu)化核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site，RBS)序列是目前提高谷氨酸棒桿菌蛋白表達(dá)的主要方法。其中，Ptac啟動(dòng)子和乳糖操縱子結(jié)合被廣泛應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌的各種載體表達(dá)[6]。在此基礎(chǔ)上，PtacM啟動(dòng)子的修飾會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)蛋白的表達(dá)[7]。此外，谷氨酸棒桿菌的幾種天然啟動(dòng)子，包括組成型啟動(dòng)子Ptuf、PcspB和Psod和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PprpD2已被應(yīng)用于工業(yè)蛋白的表達(dá)[6-9]。另外幾種合成啟動(dòng)子PH36、PI16和PL26也被應(yīng)用于構(gòu)建蛋白表達(dá)載體[10-13]。RBS序列也稱SD序列，我們前期研究證實(shí)在谷氨酸棒桿菌中Paph啟動(dòng)子與不同RBS序列結(jié)合后呈現(xiàn)出不同的蛋白表達(dá)能力[14]。作為基因表達(dá)的重要部分，RBS序列的優(yōu)化也已應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌的代謝工程。通過(guò)構(gòu)建RBS文庫(kù)和調(diào)節(jié)信號(hào)通路基因aroG、aroB、aroD和aroE的RBS強(qiáng)度，建立了幾個(gè)遺傳模塊來(lái)提高谷氨酸棒桿菌中草酸的產(chǎn)量[15]。實(shí)際上，啟動(dòng)子下游的一小段轉(zhuǎn)錄非編碼區(qū)(5′UTR)不僅包含更多的RBS序列，而且還包含可能影響啟動(dòng)子活性的特殊序列[16]。與僅有幾個(gè)堿基的RBS相比，5′UTR包含大量特殊序列，使其具有更高的修飾潛力。

本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中已經(jīng)證明了在谷氨酸棒桿菌中,與單順?lè)醋虞d體(monocistronic expression model,MEM)相比雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體(bicistronic expression model,BEM)能夠顯著提高載體的表達(dá)能力[5]。研究利用不同的5′UTR及其下游序列與不同啟動(dòng)子組成新的表達(dá)組件，實(shí)現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)載體篩選，對(duì)擴(kuò)展谷氨酸棒桿菌的工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、生長(zhǎng)條件和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α和谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5α用于構(gòu)建表達(dá)載體；谷氨酸棒桿菌作為外源蛋白表達(dá)宿主，同時(shí)為5′UTR序列的PCR提供基因組模板。氯霉素的終濃度在大腸桿菌中為30 mg/L，在谷氨酸棒桿菌中為10 mg/L。VHH蛋白基因及分泌信號(hào)肽T1514片段從本實(shí)驗(yàn)室保存的p19-T1514-VHH載體擴(kuò)增得到。pH36-EGFP是基于本實(shí)驗(yàn)室保藏的pE-0載體構(gòu)建攜帶PH36啟動(dòng)子和報(bào)告基因EGFP的質(zhì)粒，pTac-EGFP是基于pXMJ19構(gòu)建攜帶Ptac啟動(dòng)子和EGFP報(bào)告基因EGFP的質(zhì)粒[17]。

表1 5′RACE所用的引物Table 1 Primers in 5′RACE experiment

1.2 cDNA 5′末端快速擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)(5′RACE)

cDNA末端快速擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)(rapid amplification of cDNA ends,RACE)是基于PCR從低豐度轉(zhuǎn)錄本中通過(guò)快速擴(kuò)增獲得cDNA 完整5′和3′末端的有效方法。根據(jù)谷氨酸棒桿菌中蛋白質(zhì)表達(dá)的豐度，列出了12個(gè)基因[18](表2)，并且使用5′RACE分析法鑒定了不同基因的5′UTR序列及其下游部分序列。如圖1(a)所示，在谷氨酸棒狀桿菌過(guò)夜培養(yǎng)后，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，并利用細(xì)菌總RNA提取試劑盒(TakaRa，中國(guó))提取谷氨酸棒狀桿菌的總RNA。然后使用基因特異性引物(gen-specific primer,GSP1)在有逆轉(zhuǎn)錄酶(GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit)的作用下使基因片段內(nèi)部合成cDNA的第一條鏈，同時(shí)用RNAse混合物降解模板mRNA，并純化合成cDNA，通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶將dCTP或dGTP連續(xù)添加到cDNA鏈的3′末端，以形成寡核苷酸(dG或dC)尾巴。最后使用基因片段內(nèi)部寡聚錨定引物(anchor primer,AP)和另一種基因特異性引物(GSP2)進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序得到連續(xù)寡核苷酸(dG或dC)尾巴下游即為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSP)，通過(guò)與序列庫(kù)比對(duì)以獲得5′UTR及其基因的下游部分序列。

TSP:轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。圖1 利用5′RACE鑒定5′UTR及其下游序列(a);5′UTR及其下游序列與啟動(dòng)子組成新的表達(dá)載體的構(gòu)建(b)Figure 1 Identification of 5′UTR and its downstream sequence by 5′RACE(a);construction new expression vectors by combining promoter with different 5′UTR and its downstream sequence(b)

1.3 5′UTR表達(dá)載體的構(gòu)建和插入

如圖1(b)所示，在單順?lè)醋颖磉_(dá)模型MEM中，將從基因組中克隆的5′UTR利用同源重組的方式插入到pH36-EGFP載體中。由不同5′UTR序列和H36啟動(dòng)子組成的新表達(dá)載體根據(jù)基因名分別命名為pH36-M2673/0935/2501/2473/2328/2826/0572/0533/1316UTR-EGFP。而在雙順?lè)醋颖磉_(dá)模型BEM中，將不同基因的5′UTR及其下游62 bp和保守SD(AAAGGAGGACAACTAATG)序列分別重組到pH36-EGFP及pXMJ19-EGFP載體上，構(gòu)成新的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，分別命名為pH36-B2673/0935/2501/2473/2328/2826/0572/0533/1316UTR-EGFP和pTacB2673/0935/2501/2473/2328/2826/0572/0533/1316UTR-EGFP。pH36-EGFP和pTac-EGFP分別作為陰性對(duì)照pH36-Negative和pTac-Negative,而將保守SD序列插入pH36-EGFP和pTac-EGFP分別為陽(yáng)性對(duì)照載體pH36-Positive和pTac-Positive。

圖 2 5′UTR序列與PH36啟動(dòng)子組成新的單順?lè)醋虞d體的熒光強(qiáng)度以及5′UTR對(duì)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平的影響(a)；5′UTR及其下游序列與PH36啟動(dòng)子組成的雙順?lè)醋虞d體egfp蛋白的表達(dá)(b)Figure 2 Fluorescence intensity of monocistronic expression element consisting of PH36 promotor and 5′UTR and relative mRNA of EGFP gene for each part(a);egfp protein expression of different expression elements in BEM compared with MEM(b)

1.4 熒光強(qiáng)度測(cè)定

用報(bào)告蛋白EGFP檢測(cè)不同5′UTR的表達(dá)強(qiáng)度。將成功構(gòu)建的具有不同5′UTR表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒狀桿菌中，分別從平板上選取3個(gè)轉(zhuǎn)化子將其轉(zhuǎn)染至24孔板中(每孔含2 mL LBB培養(yǎng)基)。30 ℃以220 r/min培養(yǎng)約12 h后，將谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)接至新的24孔板(每孔含2 mL LBB培養(yǎng)基)中，初始OD600為0.05，二次活化培養(yǎng)3 h后，在含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子tac的每個(gè)孔中添加1 mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG，添加IPTG繼續(xù)培養(yǎng)24 h后測(cè)量熒光強(qiáng)度，組成型啟動(dòng)子PH36不需要添加誘導(dǎo)劑。

用培養(yǎng)基將酶標(biāo)儀進(jìn)行標(biāo)零，取培養(yǎng)后的菌液加入培養(yǎng)基進(jìn)行充分稀釋，使稀釋終濃度OD600為0.4～0.7，利用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液的OD600濃度并記錄，同時(shí)利用熒光計(jì)測(cè)定稀釋后菌液的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)：488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：507 nm)，計(jì)算單位OD600的熒光強(qiáng)度以指示不同5′UTR的表達(dá)強(qiáng)度。每種菌液取3次樣測(cè)量作為技術(shù)重復(fù)，每個(gè)載體轉(zhuǎn)化后選取3個(gè)轉(zhuǎn)化子作為生物學(xué)重復(fù)。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)

為驗(yàn)證5′UTR是否會(huì)影響啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，分析單順?lè)醋虞d體中EGFP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。取搖瓶培養(yǎng)過(guò)夜菌液，如方法1.2所述，進(jìn)行谷氨酸棒桿菌總RNA提取和cDNA合成。qRT-PCR程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s；95 ℃變性15 s，65 ℃退火30 s和95 ℃持續(xù)退火15 s，以16S rRNA為標(biāo)準(zhǔn)，使用2-△△Ct方法分析相對(duì)EGFP的轉(zhuǎn)錄水平[19]。每種樣品進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

1.6 VHH表達(dá)載體的構(gòu)建

為分析新表達(dá)載體在谷氨酸棒狀桿菌中生產(chǎn)重組蛋白的實(shí)用性，選擇3株高強(qiáng)度表達(dá)載體pTac-B2826/2328/2473UTR對(duì)重組蛋白VHH進(jìn)行分泌表達(dá)。從p19-T1514-VHH載體中擴(kuò)增出帶有T1514信號(hào)肽的VHH基因片段，并利用重組的方法將其克隆到3個(gè)載體中，從而構(gòu)建了pTac-B2826/2328/2473UTR-VHH 3種蛋白表達(dá)載體。并將6×His標(biāo)簽添加到VHH蛋白質(zhì)的C末端，以簡(jiǎn)化目標(biāo)蛋白質(zhì)的檢測(cè)和純化。

1.7 VHH-His的純化和分析

將帶有表達(dá)效果最好的載體pTac-B2826-VHH的谷氨酸棒桿菌菌株在LBB培養(yǎng)基中于30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后以1∶50的比例轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 h后當(dāng)OD600為0.6時(shí)加入1 mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG。培養(yǎng)24 h后，通過(guò)離心和過(guò)濾收集培養(yǎng)上清液。然后，用AKATa系統(tǒng)(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)中的HisTrap HP色譜柱純化VHH-His蛋白。純化后蛋白質(zhì)應(yīng)用雙辛可寧酸(BCA)、SDS-PAGE以及Western Bolt測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 從高蛋白表達(dá)基因中篩選和鑒定5′UTR序列

在谷氨酸棒桿菌中篩選表達(dá)量最高的12個(gè)基因[18]。通過(guò)5′RACE實(shí)驗(yàn)，成功鑒定5′UTR及其基因下游的部分序列(表2)。這12個(gè)基因中有9個(gè)具有5′UTR序列，而其中3個(gè)基因啟動(dòng)子直接與基因起始密碼子ATG連接而缺少5′UTR序列。

表2 在谷氨酸棒桿菌中篩選蛋白表達(dá)豐度最高的12個(gè)基因和其5′UTR及下游部分序列Table 2 Twelve genes with the highest protein abundance in Corynebacterium glutamicum and 5′UTR and its downstream sequences

2.2 不同5′UTR序列對(duì)蛋白表達(dá)的影響

首先測(cè)量單順?lè)醋颖磉_(dá)模型(MEM)中的熒光強(qiáng)度。如圖2(a)所示，不同的5′UTR對(duì)蛋白表達(dá)水平的影響不同，然而單順?lè)醋颖磉_(dá)模型中僅含PH36啟動(dòng)子的表達(dá)元件并未顯示出文獻(xiàn)中的高表達(dá)強(qiáng)度[10]，這可能是由于實(shí)驗(yàn)中菌株種類的不同造成的差異。然而，含有帶有5′UTR序列的PH36的表達(dá)元件顯著提高了egfp蛋白的表達(dá)，這證明內(nèi)源表達(dá)元件5′UTR確實(shí)在谷氨酸棒桿菌中對(duì)蛋白的表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用。與陽(yáng)性對(duì)照pH36-Positive相比，具有不同5′UTR序列的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)了egfp蛋白的熒光強(qiáng)度從1.03倍增加到11.65倍。為進(jìn)一步探討5′UTR影響基因表達(dá)的方式，通過(guò)qRT-PCR分析，以檢測(cè)表達(dá)過(guò)程中不同表達(dá)載體中EGFP基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。這些結(jié)果表明，不同5′UTR序列能夠顯著影響著啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平，這也說(shuō)明5′UTR序列不僅影響蛋白的翻譯效率，同時(shí)也對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄有著重要影響。

2.3 5′UTR及其下游序列在雙順?lè)醋颖磉_(dá)模型中的作用

雙順?lè)醋颖磉_(dá)模型(BEM)中的熒光強(qiáng)度如圖2(b)所示，與單順?lè)醋幽Ｐ拖啾?，雙順?lè)醋幽Ｐ椭?′UTR與啟動(dòng)子PH36組成的表達(dá)載體的表達(dá)能力有了進(jìn)一步提高，egfp蛋白的熒光強(qiáng)度分別提高了1.21～27.82倍。同樣還測(cè)量5′UTR及其下游序列與Ptac啟動(dòng)子組合形成的表達(dá)載體對(duì)egfp蛋白表達(dá)的影響(圖3)，其中載體pTac-B2826UTR表達(dá)egfp蛋白的能力最高，其熒光強(qiáng)度比陽(yáng)性對(duì)照pTac-Positive提高了 3.57倍。

圖3 5′UTR及其下游序列與Ptac啟動(dòng)子組成新的載體表達(dá)egfp蛋白的熒光強(qiáng)度Figure 3 Fluorescence intensity of egfp protein by new vectors constituted by 5′UTRs and their downstream sequences with Ptac promoter

2.4 重組蛋白VHH的分泌表達(dá)

為進(jìn)一步證明篩選出的高表達(dá)載體對(duì)外源蛋白的表達(dá)能力，用VHH替換EGFP蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。選用3柱表達(dá)強(qiáng)度最高載體(pTac-B2826/2328/2473UTR)來(lái)表達(dá)蛋白VHH(15.7 ku)，SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果[圖4(a)]表明，這3株新型表達(dá)載體均能實(shí)現(xiàn)外源蛋白在谷氨酸棒桿菌中分泌表達(dá)。發(fā)酵結(jié)束后收集上清液，并成功通過(guò)鎳柱純化出具有His標(biāo)簽的VHH蛋白,如圖4(b)。目標(biāo)蛋白VHH下面雜帶經(jīng)WB分析，可能是由于SDS電泳時(shí)溫度升高導(dǎo)致VHH蛋白出現(xiàn)部分降解所致。通過(guò)BCA蛋白濃度分析，在搖瓶中發(fā)酵24 h，VHH蛋白分泌濃度達(dá)到85.4 mg/L。

(a)泳道1為陰性對(duì)照(泳道2～4分別為pTac-B2826/2328/2473UTR-VHH載體表達(dá)VHH蛋白)；(b)泳道1～4分別為陰性對(duì)照、原液、流穿液和洗脫液。圖4 SDS-PAGE和WB分析VHH蛋白的表達(dá)(a)和純化后VHH的SDS-PAGE分析(b)Figure 4 SDS-PAGE and WB analysis of VHH protein expression (a)and SDS-PAGE analysis of purified VHH(b)

3 結(jié)語(yǔ)

篩選谷氨酸棒桿菌中12個(gè)蛋白表達(dá)豐度最高的基因，通過(guò)5′RACE實(shí)驗(yàn)成功鑒定這12個(gè)基因的5′UTR及其下游序列，通過(guò)分子克隆技術(shù)，以EGFP作為報(bào)告基因驗(yàn)證5′UTR及其下游序列對(duì)不同的強(qiáng)啟動(dòng)子PH36和Ptac的表達(dá)能力均有顯著的提升作用，并利用表達(dá)能力最強(qiáng)的載體成功在谷氨酸棒桿菌實(shí)現(xiàn)外源蛋白VHH的分泌表達(dá)。