楊志金,徐 江 ,盛曉飛 ,陳 康 ,段少飛 ,李 斌 ,唐康來

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二O醫(yī)院康復醫(yī)學科,昆明 650032；2.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院骨科運動醫(yī)學中心，重慶 400038

肌腱損傷在體育運動及其他劇烈活動中均十分常見。肌腱自身再生能力較差，自然愈合常形成瘢痕組織，導致機械性能下降，且容易再次損傷。肌腱損傷的常規(guī)治療方法包括非手術治療及手術治療，但這些治療方法均療效有限，不能恢復肌腱的自然結構及機械性能。干細胞治療有促進損傷肌腱組織再生的潛能，肌腱干細胞(tendon stem cells，TSCs)是來源于肌腱的間充質干細胞。肌腱組織工程使用TSCs促進損傷肌腱組織再生，是一項極有前景的治療方法。

干細胞局部注射很難避免細胞滲漏等問題，且干細胞也很難在損傷部位長時間駐留，因此需研究更適宜的干細胞移植技術?？墒褂蒙镏Ъ懿牧习杉毎植孔⑸渲委熂‰鞊p傷，同時TSCs也需要合適的支架材料以保持其干性，及成肌腱分化方向。水凝膠是制作組織工程支架最經(jīng)濟、有效的方法，水凝膠為移植的干細胞提供了一個模擬肌腱細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的載體和微環(huán)境。殼聚糖(Chitosan,C)/β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate,GP)/膠原(collagen,Co)水凝膠是近年組織工程領域重點關注的一種可注射溫敏水凝膠，其加入了肌腱組織的主要組成成分Ⅰ型膠原，可能更適宜作為肌腱組織工程支架。

外源性干細胞移植在組織再生及功能修復方面極具前景[1]。干細胞移植后遷移到損傷部位，存活并分化為靶細胞而發(fā)揮功能。確定移植的干細胞是否可以定位在受損的器官或組織中，是干細胞移植治療的基礎[2]。為了監(jiān)測干細胞在體內(nèi)的分布、存活、增殖、分化等生物學行為，合適的干細胞示蹤技術起到至關重要的作用[3-4]?；铙w光學成像技術(optical imaging,OI)由于具有損傷小、靈敏度高、實時動態(tài)監(jiān)測和沒有放射性等優(yōu)點，是近年研究的熱點。其中近紅外(near-infrared,NIR)熒光探針在細胞培養(yǎng)及動物體內(nèi)實驗中均有廣泛研究[5]。菁染料是目前被廣泛應用的一種近紅外熒光探針，吲哚菁綠(Indocyanine green,ICG)已被食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)批準應用于臨床，包括：心臟功能檢測、眼科視網(wǎng)膜血管造影及肝功能檢測等[6-7]。同時ICG被用于干細胞的標記示蹤[8]。雖然ICG的臨床應用廣泛，但它為水溶性熒光探針，在體內(nèi)代謝較快，成像時間較短。且用于標記干細胞的標記效率低、熒光信號強度較弱等因素限制了其在干細胞體內(nèi)示蹤中的應用。IR-780碘化物是一種新型的近紅外七甲川花菁類熒光探針，具有良好的光學特性。IR-780碘化物用于標記干細胞，具有良好的生物相容性及獨特的光學性能[9]。

本研究擬對用IR-780碘化物標記，由C/GP/Co水凝膠包裹，移植至動物體內(nèi)的TSCs進行示蹤觀察，觀察移植后帶熒光標記的TSCs的分布及存活情況，為進一步C/GP/Co水凝膠包裹TSCs移植至體內(nèi)的動物實驗奠定基礎。

材料與方法

1 材料

1.1實驗動物 14只雄性SD大鼠(4周齡，體重約100g，陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)。所有動物嚴格按照實驗動物治療和處理指南進行處理，實驗程序均由陸軍軍醫(yī)大學動物研究醫(yī)學倫理委員會批準[SYXK(渝)20170002]。

1.2主要試劑 低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)；胎牛血清(Gibco公司，美國)；Ⅰ型膠原酶(Sigma公司，美國)；胰蛋白酶(Hyclone公司，美國)；青-鏈霉素雙抗(Hyclone公司，美國)；Hoechst染色液(上海碧云天公司，中國)；Mito-Tracker Green (Invitrogen公司，美國)；IR-780碘化物(Sigma公司，美國)；RNaseA(北京鼎國昌盛公司，中國)；PI染色液(北京鼎國昌盛公司，中國)；CCK-8試劑盒(合肥Biosharp公司，中國) ；PBS緩沖液(北京中杉金橋公司，中國)；DAPI染色液(上海碧云天公司，中國)。

1.3主要儀器 YJ-1450型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠，中國)；3211型細胞培養(yǎng)箱(Forma公司，美國)；37℃恒溫水浴箱(哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠，中國)；90-2型磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠，中國)；OLYMPUS-IX70熒光顯微鏡(Olympus 公司，日本)；Leica TCS SP2激光共聚焦顯微鏡(Leica公司，德國)；KODAK多功能活體成像系統(tǒng)(KODAK公司，美國)；FACStar Plus 流式細胞儀(BD公司，美國)；iMarkTM酶標儀(Bio-Rad 公司，美國)。

2 方法

2.1IR-780碘化物的配制 IR-780碘化物為深綠色粉末，用二甲亞砜(DMSO)溶解后調整濃度至10mM，分裝至1.5mL EP管，置于-20℃冰箱避光保存。

2.2大鼠跟腱來源TSCs的分離及培養(yǎng) 取4周齡SD雄性大鼠2只，體重約100g，CO2麻醉處死后，無菌條件下取雙側跟腱中段組織，剔除腱鞘及腱周結締組織。將肌腱均勻剪碎成1mm×1mm組織塊，每100mg肌腱組織加入含3mg/mLⅠ型膠原酶和4mg/mL中性蛋白酶混合溶液1mL，37℃孵箱消化2h。加入與消化液等體積的10%胎牛血清(FBS)溶液終止消化，收集細胞懸液，用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞。細胞計數(shù)后，用含20%FBS的適量DMEM培養(yǎng)基調整細胞密度至(1～2)×104cells/mL，將混懸液種植于75cm2細胞培養(yǎng)瓶中，10mL/瓶，將培養(yǎng)瓶置于37℃、CO2濃度為5%的孵箱中靜置培養(yǎng)。每3d更換培養(yǎng)基并在顯微鏡下觀察生長情況。當細胞生長至70%～80%融合時，即可傳代。原代為P0代，擴增至P1～P3代用于進一步實驗。取P2代細胞進行克隆形成能力及成骨、成軟骨、成脂肪分化等實驗，鑒定為TSCs 后用于后續(xù)實驗[10]。

2.3C/GP/Co水凝膠的配制 在超凈臺中，冰浴條件下吸取6mL C溶液加入10mL無菌離心管中，置于冰上預冷。再將1mL GP溶液逐滴加入到C溶液中并不斷震蕩離心管，使其充分混合均勻，即可獲得C/GP溶液，體積比為6∶1。將7mLC/GP溶液加入50mL無菌離心管中，將8mL 2mg/mL的Co溶液快速加入C/GP溶液中，不斷震蕩離心管，使其充分混合均勻，即可獲得C/GP/Co溶液，體積比為6∶1∶8。

2.4IR-780碘化物標記TSCs細胞內(nèi)定位 將P2代TSCs從培養(yǎng)瓶消化下來，調整濃度為5×106/mL，分裝于5個1.5mL無菌EP管中，每個EP管200μL。1 000rpm離心5min后棄上清，以含IR-780碘化物20μM的無血清DMEM培養(yǎng)基200μL重懸細胞?；靹蚝笾糜?7℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育15min。用含10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸為單細胞懸液，調整細胞濃度為2×105/mL。將標記好的TSCs按照1mL/皿接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h細胞完全貼壁，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，每次5min。每個培養(yǎng)皿加入1mL含100nM Mito-Tracker Green熒光探針的培養(yǎng)基，37℃孵育30min，用Hoechst染色液復染細胞核。激光共聚焦顯微鏡下觀察IR-780碘化物標記TSCs的細胞內(nèi)定位。

2.5檢測IR-780碘化物標記TSCs的陽性率 IR-780碘化物標記TSCs方法同上，1 000rpm離心5min后棄上清，用4%多聚甲醛固定30min，再次1 000rpm離心5min后棄上清。每樣品管加入200μL PBS溶液重懸，制備為單細胞懸液，使用FACStar Plus流式細胞儀檢測IR-780標記的陽性細胞比例，以正常未標記TSCs為陰性對照。

2.6檢測IR-780碘化物標記TSCs對其細胞周期的影響 將P2代TSCs從培養(yǎng)瓶消化下來，調整細胞濃度為5×106/mL，分裝于15 mL離心管中。1 000rpm離心5min后棄上清，以含IR-780碘化物20μM的無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細胞?；靹蚝笾糜?7℃、5% CO2孵箱內(nèi)孵育15min。用含10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸為單細胞懸液，調整細胞濃度為2×105/mL。將標記好的TSCs及正常TSCs按照2×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，IR-780碘化物標記細胞及正常細胞完全貼壁，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，每次5min。用0.25%胰蛋白酶分別將IR-780碘化物標記細胞及正常細胞從培養(yǎng)瓶消化下來，1 000rpm離心5min，棄上清。用PBS溶液重懸細胞，并轉移至1.5mL EP管中，1 000rpm離心5min后棄上清。分別加入70%冷乙醇溶液固定IR-780碘化物標記細胞及正常細胞，置于4℃冰箱，過夜。分別加入RNase A，37℃條件下30min。分別加入PI，37℃條件下10min。使用FACStar Plus流式細胞儀檢測IR-780標記細胞及正常細胞的細胞周期。

2.7檢測IR-780碘化物標記TSCs對其增殖的影響 將標記好的P2代TSCs及正常P2代TSCs按照2×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，IR-780碘化物標記細胞及正常TSCs完全貼壁，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，每次5min。用0.25%胰蛋白酶分別將IR-780碘化物標記細胞及正常TSCs從培養(yǎng)瓶消化下來，1 000rpm離心5min，棄上清。用含10%FBS的完全培養(yǎng)基將IR-780碘化物標記細胞及正常TSCs重懸制備為單細胞懸液，調整細胞濃度為2×104/mL。將IR-780碘化物標記細胞及正常TSCs單細胞懸液分別加入到96孔板中，每孔加入100μL細胞懸液，即每孔細胞總數(shù)為0.2×104/孔。將96孔板置于37℃、5% CO2孵箱中，靜置培養(yǎng)，每3d換液1次。在培養(yǎng)1、4、7d后，按10μL/孔分別加入CCK-8試劑，置于37℃、5% CO2孵箱中，靜置培養(yǎng)2h后在酶標儀上讀取波長為450nm的光密度值(optical density,OD)。各組每個時間點設置6個復孔。

2.8C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標記的TSCs體內(nèi)活體成像觀察 4只SD大鼠用于活體成像觀察，用2.5%戊巴比妥鈉溶液按大鼠體重(4.5mg/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠左側后肢置于伸膝、踝背屈90°、稍外展位固定，使左側跟腱暴露清楚。每只大鼠的左側后肢制作跟腱缺損模型，右側后肢不做任何處置。將大鼠左側后肢局部褪毛，常規(guī)消毒鋪巾。將SD大鼠左側跟腱處皮膚縱行切開約1.5 cm，鈍性分離跟腱周圍組織，將跟腱完整暴露。然后將跟腱中間1/3完整切除，上至肌腱連接處，下至跟骨，缺損大小約10mm×1mm。術后用絲線逐層縫合皮膚及皮下組織。由同一名術者完成4只SD大鼠的左側跟腱缺損模型制作。

在超凈臺中，冰浴條件下制備C/GP/Co溶液1.5mL。收集IR-780碘化物標記的TSCs 4×106個，將4×106個細胞加入1.5mL C/GP/Co溶液中，充分混合均勻，備用。用1mL注射器抽取300μL上述混合溶液，注射至大鼠左側跟腱損傷部位。用相同方法，由同一名術者依次完成4只SD大鼠左側跟腱的注射。將4只SD大鼠分籠飼養(yǎng)，自由活動。4只SD大鼠分別于注射后1、7、14、28d用CO2麻醉后，置于KODAK多功能活體成像系統(tǒng)內(nèi)觀察，用Kodak MI software 5.0.1軟件進行熒光信號強度分析。

2.9C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標記的TSCs體內(nèi)注射后的組織學分析 8只SD大鼠用于組織學分析，大鼠跟腱損傷模型及C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標記的TSCs注射方法同上。分別于注射后1、7、14、28d隨機取2只SD大鼠，用CO2過度麻醉法處死后，取材用于組織學觀察。先剔除大鼠跟腱腱膜及周圍脂肪組織，放入組織盛裝盒內(nèi)，加入組織保存液，迅速轉移至-80℃冰箱，冷凍30min。待肌腱組織冷凍為固體后，轉移至冰凍切片機切片，切片厚度8μm。將兩張相鄰切片貼附于干凈的載玻片上，4%多聚甲醛固定30min，室溫晾干。用DAPI染色液染色10min，水溶性封片劑封片。切片于Leica激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計學分析

結 果

1 IR-780碘化物標記TSCs的細胞內(nèi)定位

激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見IR-780碘化物標記TSCs的熒光信號呈紅色，分布在細胞胞漿，呈點狀及線狀形態(tài)。用線粒體特異性探針Mito-tracker green雙標后發(fā)現(xiàn)，Mito-tracker green的綠色熒光與IR-780紅色熒光共同定位于細胞線粒體，證實IR-780標記TSCs定位于細胞線粒體內(nèi)。見圖1。

圖1 IR-780碘化物標記大鼠TSCs細胞內(nèi)定位。Hoechst染細胞核，呈藍色；Mito-tracker green為綠色熒光；IR-780為紅色熒光。標尺：2μm

2 流式細胞儀檢測IR-780碘化物標記TSCs的陽性率

IR-780碘化物標記的TSCs經(jīng)流式細胞儀檢測，細胞標記陽性率95.75%，熒光強度顯著高于對照組細胞。見圖2。

3 IR-780碘化物標記對TSCs細胞周期的影響

IR-780碘化物標記的TSCs經(jīng)流式細胞儀檢測，結果證實：IR-780對TSCs的細胞周期無顯著影響。IR-780碘化物標記的TSCs與正常TSCs的細胞周期比較差異無統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 IR-780碘化物標記大鼠TSCs對其細胞周期的影響。 a.正常TSCs的細胞周期；b.IR-780碘化物標記的TSCs的細胞周期

圖2 流式細胞儀檢測IR-780碘化物標記TSCs的陽性率。a.正常TSCs；b.IR-780碘化物標記的TSCs

4 IR-780碘化物標記對TSCs細胞增殖能力的影響

TSCs及IR-780碘化物標記TSCs在培養(yǎng)1、4及7d時兩組細胞的OD值均逐漸增高，與正常TSCs相比，IR-780碘化物標記對細胞的增殖能力無顯著影響，各時間點兩組之間差異無統(tǒng)計學意義。見圖4。TSCs及IR-780碘化物標記TSCs在培養(yǎng)1、4及7d時兩組細胞的OD值均逐漸增高，各時間點兩組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。

圖4 CCK-8法檢測IR-780碘化物標記TSCs增殖的影響

5 C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標記的TSCs在大鼠體內(nèi)活體成像觀察

大鼠左側跟腱損傷部位注射C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標記的TSCs溶液后，分別于注射后1、7、14、28d活體成像觀察。注射后1d活體成像觀察顯示：大鼠左側跟腱損傷區(qū)域及周圍，可檢測到強熒光信號，與周圍組織比較明顯。注射后7、14及28d，隨著時間延長，熒光信號逐漸減弱，但注射后28d仍可檢測到明顯熒光信號。見圖5。

圖5 C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標記的TSCs在大鼠體內(nèi)活體成像觀察。a.注射后1d；b.注射后7d：c.注射后14d：d.注射后28d

6 激光共聚焦顯微鏡觀察

大鼠跟腱組織熒光染色激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見IR-780碘化物標記TSCs的熒光信號呈紅色，分布在細胞胞漿，DAPI染細胞核，熒光信號呈藍色。IR-780碘化物標記TSCs的熒光信號在注射后1d時最強，注射后7、14及28d，隨著時間延長，熒光信號呈逐漸減弱趨勢，但注射后28d仍可檢測到明顯熒光信號。見圖6。

圖6 C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標記的TSCs注射至大鼠體內(nèi)后激光共聚焦顯微鏡觀察。DAPI染細胞核，熒光信號呈藍色；IR-780為紅色熒光。標尺：5μm。IR-780熒光信號在1d時最強，注射后7、14及28d，熒光信號呈逐漸減弱趨勢， 28d時仍可檢測到明顯紅色熒光信號

討 論

干細胞移植治療肌腱損傷修復過程中，對移植后的干細胞進行非侵入性的實時觀察至關重要。干細胞標記及示蹤技術一直是干細胞移植損傷修復研究的難點，通過細胞示蹤技術監(jiān)測干細胞移植后在機體內(nèi)的存活、分布、增殖及分化情況，是干細胞移植治療領域關注的熱點問題。移植干細胞的示蹤及監(jiān)測，對評估其治療效果至關重要[11]。干細胞標記及示蹤技術目前常用的有熒光蛋白標記示蹤法、磁共振對比增強劑標記示蹤法、熒光染料標記示蹤法、核酸標記技術及同位素標記技術等[2]。

熒光蛋白示蹤的原理是通過質粒、腺病毒及慢病毒等載體，將熒光蛋白基因與目的基因整合后在宿主細胞內(nèi)表達，經(jīng)激發(fā)光照射后發(fā)出熒光。常見的有綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)及紅色熒光蛋白(red fluorescentprotein，RFP)等。GFP有很多優(yōu)點，不需加入底物或酶即可發(fā)射穩(wěn)定的綠色熒光，可在熒光顯微鏡下觀察活細胞情況等。但GFP標記存在實驗周期長、費用高的缺點。此外，GFP還存在表達水平在不同動物個體間及同一動物不同細胞間差異很大；移植前GFP高表達，移植后可能出現(xiàn)低表達等[12]。磁共振對比增強劑標記示蹤法，其原理是在體外將待移植細胞用MRI增強劑標記后移植至體內(nèi)，然后利用MRI對細胞進行追蹤。目前研究較多的是磁共振示蹤劑是超順磁性氧化鐵(SPIO)，但其細胞標記率較低，且MRI檢測不能反映干細胞的存活狀態(tài)和微環(huán)境的變化[13]。

NIR熒光成像技術具有較強的組織穿透能力，NIR在其光譜范圍內(nèi)能在機體及組織自發(fā)熒光，對組織細胞的低毒性及高敏感性等特點，且可以實時、無創(chuàng)、體外連續(xù)監(jiān)測，檢測靈敏度高、操作較容易，并能進行非侵入式的實時深層組織成像，在干細胞標記示蹤中展現(xiàn)出巨大的應用潛力[14-15]。

七甲川花菁染料作為一類經(jīng)典的近紅外熒光探針，當前已廣泛應用于生物醫(yī)學成像研究。IR-780碘化物是七甲川菁染料中的一種新型近紅外熒光小分子，在干細胞標記、移植后動物活體成像及組織學檢查中均有明顯優(yōu)勢。Zhang等[9]用近紅外熒光染料IR-780碘化物對大鼠來源皮膚干細胞等進行標記，研究結果表明：IR-780碘化物能簡單、有效地標記干細胞，且對干細胞的增殖、分化影響較小，此外部分來自標記細胞的泄漏染料可以被血液循環(huán)系統(tǒng)清除掉，對干細胞周圍未標記的細胞影響不明顯。

本實驗研究結果表明，IR-780碘化物可有效標記TSCs，靈敏度高、特異性強、操作簡單、方便價廉，對細胞或機體影響小。IR-780碘化物標記TSCs后定位于細胞的線粒體內(nèi)，對細胞周期及細胞增殖能力無明顯影響。IR-780碘化物標記的TSCs在活體成像系統(tǒng)可實現(xiàn)長時間示蹤及觀察，且可在激光共聚焦顯微鏡下行組織學觀察。

筆者的研究結果證實：IR-780碘化物可有效標記TSCs并用于實時示蹤，C/GP/Co水凝膠包裹IR-780碘化物標記的TSCs注射至大鼠跟腱損傷部位后，TSCs在肌腱損傷部位存活良好，IR-780碘化物標記TSCs的熒光信號在注射后1d時最強，注射后7、14及28d，隨著時間延長，熒光信號呈逐漸減弱趨勢，但注射28d后活體成像及激光共聚焦顯微鏡觀察仍可檢測到明顯熒光信號，且大鼠身體其他部位從注射后1～28d均無顯著IR-780碘化物熒光信號。TSCs通過C/GP/Co水凝膠包裹注射至大鼠跟腱損傷部位，可長時間存活并駐留于損傷部位發(fā)揮治療效應。C/GP/Co水凝膠包裹TSCs可用于進一步的動物跟腱損傷體內(nèi)實驗研究。