劉偉 鞠青 劉星辰

摘要：采用單因子急性毒性實驗研究Pb2+、Cu2+和Cd2+對太平洋牡蠣（Crassostreagigas）的96h半數(shù)致死濃度（96hLC50）及急性毒性效應(yīng)。實驗結(jié)果表明，Pb2+、Cu2+和Cd2+對太平洋牡蠣96hLC50分別為22-99、21.75mg/L和21.35mg/L，急性毒性作用大小的順序為：Cd2+>Cu2+>Pb2+。Pb2+、Cu2+和Cd2+對太平洋牡蠣的安全濃度（SC）分別為：2.30、2.18mg/L和2.14mg/L。總體而言，與Cu2+和Pb2+相比，太平洋牡蠣對Cd2+毒性的耐受性較低。

關(guān)鍵詞：太平洋牡蠣（Crassostreagigas）;重金屬;半致死濃度;安全濃度

重金屬以其高毒性、難以降解、持久殘留且極易沿食物鏈傳遞等特點，已經(jīng)成為全球性的主要環(huán)境污染源之一[1]。各種工業(yè)廢水和固體廢棄物未經(jīng)徹底的無害化處理，而直接排放到環(huán)境中[2-3]，最終導(dǎo)致重金屬以地表徑流、大氣降水等方式進(jìn)入海洋[4-5]。在理化及生物作用下，重金屬會富集于沉積物及懸浮物中，并被蓄積在多種海洋生物體內(nèi)。其中，最常見的重金屬污染物為Cd、Cu、Hg、Zn和Pb等[6]。在海洋中，極微量的重金屬并不會對生物體產(chǎn)生危害，甚至少量的Zn、Cu和Mn等重金屬是維持海洋生物正常生命活動所必需的元素，這類重金屬被稱為必需重金屬[7-9]。但是，高過一定閾值的必需重金屬會對海洋生物產(chǎn)生毒性影響[10-11]。同時，一些不參與海洋生物機(jī)體代謝的非必需重金屬（如Pb和Cd等），在較低濃度時就會對生物體產(chǎn)生毒性效應(yīng)[12-13]。

牡蠣作為我國重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一，由于其分布廣泛、營固著型和濾食性生活等特征，對重金屬的富集能力較強(qiáng)。此外，牡蠣對某些重金屬污染物（如Pb和Cd等）的富集能力遠(yuǎn)高于其它海洋生物，因此被認(rèn)為是一種理想的海洋污染指示生物。

本實驗以太平洋牡蠣（Crassostreagigas）為研究對象，采用靜態(tài)急性毒性的實驗方法，研究了Pb2+、Cu2+和Cd2+對太平洋牡蠣的急性毒性效應(yīng)，同時計算Pb2+、Cu2+和Cd2+對太平洋牡蠣的96h半致死濃度（96hLC50）和安全濃度（SC），比較幾種重金屬污染物對牡蠣的毒性影響，以期為海洋生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和牡蠣養(yǎng)殖提供技術(shù)支持，同時為海洋污染物的監(jiān)測指示提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗用牡蠣及暫養(yǎng)

本研究所用的太平洋牡蠣采自煙臺乳山灣附近海區(qū)牡蠣養(yǎng)殖場，于采集后12h內(nèi)送至實驗室內(nèi)。為保證實驗對象的同一性及代表性，選取大小均勻的健壯個體作為實驗對象。太平洋牡蠣洗刷干凈并清除附著物后，置于0.8m×0.5m×0-8m的大型養(yǎng)殖箱內(nèi)馴化3d，期間不投喂餌料，24h連續(xù)充氣增氧。

馴化處理后的牡蠣繼續(xù)暫養(yǎng)，養(yǎng)殖密度為50～60個/m3。暫養(yǎng)期間采用靜態(tài)換水法，每24h換水1/2～2/3，連續(xù)充氧。養(yǎng)殖水體的鹽度為29‰，pH值為7.5，培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，培養(yǎng)光強(qiáng)10μmol·m-2·s-1，光周期為12h光∶12h暗。暫養(yǎng)及實驗期間投喂金藻和青島大扁藻作為餌料。當(dāng)太平洋牡蠣活動正常且死亡率低于5℅時，停止暫養(yǎng)，進(jìn)行毒性實驗。實驗前1天停止投餌，挑選長度為（3.5±0.5）cm的牡蠣個體進(jìn)行96h急性毒性實驗。

實驗用水的水質(zhì)符合NY5052-2001《海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》。實驗用海水為取自青島太平角附近的天然海水，經(jīng)過濾、曝氣后備用。由于實驗過程中理化條件的變化會對Cd2+和Pb2+的形態(tài)產(chǎn)生顯著影響，為確保實驗結(jié)果準(zhǔn)確，需保證實驗期間水溫為（21±2）℃，其他培養(yǎng)條件基本穩(wěn)定。

實驗采用CdC12·2.5H2O、Pb（NO3）2和Cu（NO3）2三種重金屬污染物，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，配置成質(zhì)量濃度為20mg/mL的Cd2+、Pb2+和Cu2+母液，實驗時用海水稀釋至所需濃度。

1.2急性毒性實驗

參照預(yù)實驗確定的96h最大耐受濃度和100%致死濃度，按照等對數(shù)間距法，每種重金屬均設(shè)置15.00、20.25、27.34、36.91、50.00mg/L5個脅迫濃度和一個對照組。每組放養(yǎng)馴化后的太平洋牡蠣50只，設(shè)3個平行。實驗所用養(yǎng)殖箱為35cm×20cm×11cm的塑料箱，每個養(yǎng)殖箱加入4L曝氣海水。每24h更換含相應(yīng)濃度重金屬的海水，其他培養(yǎng)條件與暫養(yǎng)相同。實驗期間定時觀察牡蠣狀態(tài)，及時清除死貝。當(dāng)太平洋牡蠣呈雙殼張開，外套膜萎縮，多次刺激開口牡蠣外殼邊緣，3min內(nèi)無反應(yīng)即可判定死亡。記錄各組在24h、48h、72h和96h的死亡牡蠣個數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)處理和分析

實驗完成后，統(tǒng)計各實驗組太平洋牡蠣的死亡個數(shù)并計算死亡率。利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計算三種重金屬（Cd2+、Pb2+和Cu2+）對太平洋牡蠣的急性毒性效應(yīng)的概率單位與濃度對數(shù)的回歸方程[14]及其24h和96h的半數(shù)致死濃度（24h和96hLC50），安全濃度（SC）采用SC=0-1×96hLC50求出[15]。

2結(jié)果與分析

2.1中毒癥狀

在不同濃度重金屬離子脅迫下，太平洋牡蠣呈現(xiàn)顯著的中毒反應(yīng)，其通過閉殼的方式躲避重金屬的毒性。在低濃度處理組中，太平洋牡蠣生活情況與對照組基本相同，但是隨著脅迫時間延長，受試個體對外界刺激反應(yīng)遲鈍，貝殼張閉頻率降低，死亡個體數(shù)量增加。高濃度處理組脅迫下的太平洋牡蠣中毒反應(yīng)迅速，短期內(nèi)大量死亡。

2.2Pb2+對太平洋牡蠣的急性毒性效應(yīng)

由圖1可見，隨著Pb2+濃度的增加和脅迫時間的延長，太平洋牡蠣的死亡率逐漸增大。當(dāng)Pb2+濃度為15.00mg/L時，直至72h后才出現(xiàn)死亡個體。在20.25mg/L脅迫組中，24h內(nèi)出現(xiàn)死亡個體，且隨著脅迫時間的延長，死亡率也逐漸升高，96h死亡率接近50%。從50.00mg/L濃度組的曲線可以看出，脅迫初期，牡蠣死亡率緩步上升，而48h到72h之間，牡蠣死亡率從50%急劇升高至100%。Pb2+對太平洋牡蠣的24hLC50為103.4mg/L。對照組在96h內(nèi)沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。通過線性回歸分析，可得其回歸方程為：y=2.509x-7.866，96h半數(shù)致死濃度96hLC50=22.99mg/L，96hSC為2.30mg/L。

2.3Cu2+對太平洋牡蠣的急性毒性效應(yīng)

Cu2+是生物體必需的重金屬元素，包括氧化酶和氧合酶在內(nèi)的30多種酶都需要銅離子協(xié)同作用，才能發(fā)揮功能[16]。太平洋牡蠣的死亡率隨Cu2+濃度的增加而升高（圖2）。低濃度處理組（15.00mg/L）牡蠣的死亡率與Pb2+低濃度組相同，72h后才出現(xiàn)死亡個體。在50.00mg/LCu2+脅迫組中，牡蠣死亡率隨脅迫時間延長逐漸增大。與Pb2+高濃度處理組不同，50mg/LCu2+并沒有導(dǎo)致太平洋牡蠣死亡率在某段時間內(nèi)急劇上升。Cu2+對太平洋牡蠣的24hLC50為62.66mg/L。對照組在96h內(nèi)沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。通過線性回歸分析，可得其回歸方程為：y=3.229x-9.942，半數(shù)致死濃度96hLC50=21.75mg/L，96hSC為2.18mg/L。

2.4Cd2+對太平洋牡蠣的急性毒性效應(yīng)

由圖3可知，與低濃度Pb2+和Cu2+脅迫處理組（15.00mg/L）不同，Cd2+脅迫組在48h內(nèi)即出現(xiàn)死亡個體。當(dāng)Cd2+濃度為50.00mg/L時，24h內(nèi)牡蠣死亡率顯著升高至60%，之后隨著脅迫時間的延長，死亡率繼續(xù)升高至100%。Cd2+對太平洋牡蠣的24hLC50為47.12mg/L。對照組在96h內(nèi)沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。通過線性回歸分析，可得其回歸方程為：y=3.926x-12-017，半數(shù)致死濃度96hLC50=21.35mg/L，96hSC為2.14mg/L。

3討論

從實驗結(jié)果可以看出，Pb2+、Cu2+和Cd2+三種重金屬離子對太平洋牡蠣都具有顯著的毒性效應(yīng)，并且隨著脅迫濃度的增加和時間的延長，死亡率顯著升高。高濃度脅迫組中，太平洋牡蠣迅速中毒，24h內(nèi)出現(xiàn)大量死亡個體。根據(jù)《新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則》（HJ/T154-2004）[17]，LC50是用于評價生物對污染物的敏感性以及污染物毒性大小的重要依據(jù)。標(biāo)準(zhǔn)將毒性物質(zhì)按等級劃分：極高毒性（96hLC50<1mg/L）、高毒（96hLC50：1～10mg/L）、中毒（96hLC50：10～100mg/L）和低毒（96hLC50>100mg/L）。根據(jù)上述毒物等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，Pb2+、Cu2+和Cd2+三種重金屬離子對太平洋牡蠣均為中等毒性。

有研究表明：Pb2+對近江牡蠣的96hLC50為43.55mg/L[13]，對菲律賓蛤仔的96hLC50為22-83mg/L[18];Cd2+和Cu2+對褶牡蠣的96hLC50分別為8.83mg/L和2.59mg/L[19]。從上述結(jié)果可以看出，同為牡蠣屬，近江牡蠣和太平洋牡蠣對Pb2+耐受度顯著不同，而太平洋牡蠣和褶牡蠣對Cd2+和Cu2+的耐受能力也有所不同。其可能的原因是與幾種牡蠣的自然分布區(qū)域及其對生境的適應(yīng)有關(guān)。近江牡蠣分布于河口附近的內(nèi)灣，易受陸源重金屬污染物的影響，對重金屬脅迫的耐受性較強(qiáng)，而太平洋牡蠣分布于遠(yuǎn)離河口的海域，受陸源重金屬污染的影響較小，因此對重金屬的耐受能力較差[13]。同一生物生長發(fā)育的不同階段，對重金屬污染的耐受能力也有所不同。有研究表明：Cd2+和Pb2+單一污染對長牡蠣（太平洋牡蠣）胚胎的半數(shù)效應(yīng)濃度分別為272.2μg/L和660.3μg/L[20]。而本研究得到的Cd2+和Pb2+對太平洋牡蠣成體的LC50分別為21.35mg/L和22.99mg/L。由于胚胎時期，太平洋牡蠣各個系統(tǒng)發(fā)育并不完善，對重金屬脅迫的適應(yīng)性和代謝較差，因此半數(shù)效應(yīng)濃度較低。成體牡蠣發(fā)育完好，抗逆能力較強(qiáng)，因此具有較高的LC50。

當(dāng)重金屬濃度為50.0mg/L時，經(jīng)24h脅迫后，Cd2+處理組死亡率為60%，顯著高于Pb2+和Cu2+實驗組（20%和40%）。在最低實驗濃度組（15.00mg/L）中，Pb2+和Cu2+實驗組出現(xiàn)死亡個體的時間是在48h后，而Cd2+實驗組48h內(nèi)出現(xiàn)死亡個體。雖然Pb2+、Cu2+和Cd2+三種重金屬96hLC50差距不大，但是24hLC50分別為103.4、62.66mg/L和47.12mg/L。因此可以推斷，太平洋牡蠣對Cd2+脅迫的耐受性較低。

根據(jù)急性毒性實驗結(jié)果，Pb2+、Cu2+和Cd2+對太平洋牡蠣的96hLC50分別為22.99、21.75mg/L和21.35mg/L，急性毒性作用大小的順序為：Cd2+>Cu2+>Pb2+。Pb2+、Cu2+和Cd2+對太平洋牡蠣的安全濃度分別為：2.30、2.18mg/L和2.14mg/L。

參考文獻(xiàn)：

[1]

邢孔敏，陳石泉，蔡澤富，等.海南東寨港表層沉積物重金屬分布特征及污染評價[J].海洋科學(xué)進(jìn)展，2018，36（3）：152-162.

[2]曾彩明，鄧杰帆，何覺聰，等.典型農(nóng)田土壤重金屬污染特征及生態(tài)風(fēng)險評價[J].東莞理工學(xué)院學(xué)報，2018，25（3）：94-98.

[3]王荔娟.福建某礦區(qū)周邊土壤重金屬來源及污染評價[J].東莞理工學(xué)院學(xué)報，2020，27（1）：85-90.

[4]王毅，王少鵬，王英輝，等.防城港近岸海域及河口溶解態(tài)重金屬污染特征[J].廣西大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2018，43（5）：393-402.

[5]WANGZX，KONGHN，WUDY.AcuteandchroniccoppertoxicitytoasaltwatercladoceranMoinamonogolicaDaday[J].Archivesofenvironmentalcontaminationandtoxicology，2007，53（1）：50-56.

[6]蔡廷祿，倪建宇，賈建軍，等.海南島典型港灣沉積物化學(xué)特征及重金屬污染評價[J].第四紀(jì)研究，2016，36（1）：93-102.

[7]HUDSONRJM.Whichaqueousspeciescontroltheratesoftracemetaluptakebyaquaticbiota？Observationsandpredictionsofnon-equilibriumeffects[J].ScienceoftheTotalEnvironment，1998，219（2-3）：95-115.

[8]SUNDAWG，HUNTSMANSA.InteractionsamongCu2+，Zn2+，andMn2+incontrollingcellularMn，ZnandgrowthrateinthecoastalalgaChlamydomonas[J].LimnologyandOceanography，1998，43（6）：1055-1064.

[9]WANGWX，DEIRCH.Metaluptakeinacoastaldiatominfluencedbymajornutrients（N，PandSi）[J].WaterResearch，2001，35（1）：315-321.

[10]FILIMONOVAV，GONALVESF，MARQUESJC，etal.Fattyacidprofilingasbioindicatorofchemicalstressinmarineorganisms：areview[J].EcologicalIndicators，2016，67：657-672.

[11]KPPERH，KPPERF，SPILLERM.Environmentalrelevanceofheavymetal-substitutedchlorophyllsusingtheexampleofwaterplants[J].JournalofExperimentalBotany，1996，47（2）：259-266.

[12]段美娜，覃亮，龍婧，等.鎘和銅對海洋浮游植物的毒性效應(yīng)及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2021，41（2）：139-148.

[13]李曉梅，郭體環(huán)，張來軍.鉛對近江牡蠣的急性毒性研究[J].瓊州學(xué)院學(xué)報，2015，22（5）：77-80.

[14]賈春生.利用SPSS軟件計算殺蟲劑的LC50[J].昆蟲知識，2006，43（3）：414-417.

[15]周永欣，章宗涉.水生生物毒性實驗方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989：1-157.

[16]孟曉林.鎘、銅分別脅迫蝦夷扇貝的毒性作用機(jī)制研究[D].青島：中國科學(xué)院海洋研究所，2013.

[17]國家環(huán)境保護(hù)總局.新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則：HJ/T154-2004[S].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2004：6-7.

[18]劉瓊玉，洪華生，蔡立哲.重金屬鋅、鉛對菲律賓蛤仔的急性毒性試驗[J].臺灣海峽，1997，16（1）：50-54.

[19]李詩逸，孫繼鵬，洪專，等.Zn2+、Cd2+、Cu2+、Cr6+和Se4+對褶牡蠣急性毒性效應(yīng)研究[J].海洋環(huán)境科學(xué)，2015，34（6）：813-818.

[20]謝嘉.典型重金屬（Cd2+、Pb2+）和有機(jī)污染物（BaP、BDE-47）對長牡蠣的復(fù)合毒性效應(yīng)研究[D].煙臺：中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，2017.

Acutetoxiceffectsofcopper，leadandcadmiumonCrassostreagigas

LIUWei1，JUQing1，LIUXingchen2

（1.ShandongProvincialQingdaoEco-environmentMonitoringCenter，Qingdao266000，China;SchoolofElectromechanicalandAutomotiveEngineering，YantaiUniversity，Yantai264005，China）

Abstract：Inthepresentstudy，the50%lethalconcentrationofcopper（Cu2+），lead（Pb2+）andcadmium（Cd2+）at96h（96hLC50）toCrassostreagigasandtheeffectofacutetoxicityresultingfromtheseheavymetalswereevaluatedbythesinglefactortest.Ourresultsshowedthatthe96hLC50ofPb2+，Cu2+andCd2+were22.99mg/L，21.75mg/Land21.35mg/L，respectively.ThetoxicityoftheseheavymetalswereCd2+>Cu2+>Pb2+.Thesafetyconcentrations（SC）were2.30mg/LforPb2+，2.18mg/LforCu2+and2.14mg/LforCd2+，respectively.Collectively，thetoleranceofCrassostreagigastoCd2+wasrelativelylowcomparedtothetolerancetoPb2+andCu2+.

Keywords：Crassostreagigas;heavymetal;lethalconcentration;safetyconcentration

（收稿日期：2021-07-22）