李婷婷，王丹丹，盧曉琦，吳發(fā)明，姚秋陽

(遵義醫(yī)科大學 藥學院，貴州 遵義 563000)

硒(Selenium,Se)是人體所必需的微量元素之一.適量硒的攝入對維護身體健康具有重要作用[1],它可以增強免疫力、延緩衰老、預防癌癥、促進生長發(fā)育和預防心血管[2-3].世界衛(wèi)生組織建議正常成年人每天硒的攝入量為50～400 μg(中國衛(wèi)生行業(yè)標準WS/T 578.3-2017).有研究顯示：人體缺硒會導致一些慢性疾病如克山病、大骨節(jié)病等[4]，而過量攝入也會導致神經系統慢性疾病、慢性脫發(fā)、皮膚損傷等，嚴重者還可能導致直接死亡，可見，適當攝入硒元素至關重要[3-4].因此測定食品或藥材中的硒元素對食品和藥品的安全和質量評價非常重要.

硒含量的測定方法包括氫化物-原子熒光光譜法(AFS)、原子吸收光譜法(AAS)、紫外可見分光光度法(UV-Vis)、高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法(HPLC-HG-AFS)以及電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)[5-8].原子吸收光譜法有嚴重的基體干擾和靈敏度低等缺點；而熒光法雖然準確但操作繁瑣，這兩種方法均有不足之處.氫化物原子熒光光譜法具有簡便、快速、準確度、精密度好，線性范圍寬，所用試劑毒性小，實用性強的優(yōu)點[9-10].現行的食品安全國家標準食品中硒的測定(GB5009.93—2017)中氫化物原子熒光光譜法是檢測食品中硒元素的首選方法.其基本原理是：樣品經消化后，在6 mol·L-1鹽酸介質中，將試樣中的Se6+還原成Se4+，在硼氫化鈉或硼氫化鉀的作用下將四價硒在鹽酸介質中還原成硒化氫[11]，硒化氫原子化后可在硒空心陰極燈照射下，在去活化回到基態(tài)時，發(fā)射出特征波長的熒光，能與標準系列比較定量.

快速、簡便、準確測定硒含量是研究富硒中藥材的關鍵技術基礎，本實驗旨在利用氫化物-原子熒光光譜法準確測定黨參的硒含量，以為富硒黨參的質量評價奠定方法學基礎.

1 材料與儀器

1.1 實驗藥材

供試11批黨參藥材來自四川成都荷花池藥材市場，由遵義醫(yī)科大學藥學院吳發(fā)明副教授鑒定為黨參.

1.2 試劑

硒酸鈉(成都艾科達化學試劑有限公司)；硼氫化鈉(上海泰坦科技股份有限公司)；鹽酸分析純(重慶川東化工有限公司)；硝酸分析純(成都市科龍化工試劑廠)；高氯酸分析純(成都市科龍化工試劑廠)；硫酸分析純(成都市科龍化工試劑廠)；硒標準溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心).

1.3 儀器

BT125D電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；PHS-25型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；101-4A電熱鼓風干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；HH-6數顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；AFS-8800雙道原子熒光光度計(北京海光儀器公司)；超純水機(德國默克密理博有限公司).

2 方 法

2.1 樣品及標準溶液的制備

2.1.1 標準品溶液的制備

1 mg·L-1的硒標準溶液：精密量取1 mL硒標準溶液(1 000 μg·mL-1)用蒸餾水定容至1 000 mL.

還原劑硼氫化鈉堿溶液(8 g·L-1)：稱取5 g氫氧化鈉于100 mL干凈的小燒杯內，加入50 mL超純水，溶解，再加入8 g硼氫化鈉，溶解完成后，將溶液轉移至1 000 mL容量瓶中，充分搖勻，用蒸餾水定容.

載流液鹽酸溶液(5+95)：量取25 mL鹽酸，緩慢加入475 mL水中，混勻.

2.1.2 樣品前處理

第2 d在加熱板上加熱(140～180 ℃，低于200 ℃)，并根據需要及時添加硝酸.當溶液為澄清無色并伴有白色煙霧時，開始趕酸(220～250 ℃)至剩余體積為1～2 mL，不可蒸干.冷卻后加入6 mol·L-1的鹽酸溶液5 mL，并繼續(xù)加熱直至溶液澄清無色，并伴有大量白煙(160 ℃，15 min).冷卻后轉移至容量瓶中，加入2.0 mL濃鹽酸，用蒸餾水定容，同時做試劑空白試驗，所有試樣均4 ℃保存?zhèn)洳?移取10.0 mL試樣消化液于15 mL離心管中，加入濃鹽酸2.0 mL，鐵氰化鉀溶液1.0 mL，混勻后放置2 h待測.采用原子熒光光譜法測定硒含量，每個處理組測量3次取平均值.

2.2 儀器條件

采用原子熒光光譜法測定黨參中硒元素含量的定量分析方法，主要參數如下：負高壓270 V；燈電流70 Ma；原子化溫度800 ℃；爐高8 mm；載氣流速500 mL·min-1；讀數方式：峰面積；讀數時間15 s；加液時間8 s；進樣體積2 mL；測量方式：標準曲線法.

2.3 標準工作曲線的繪制

精密量取“2.1.1”項下制備的硒標準溶液0、0.50、1.00、2.00和4.00 mL于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度.該硒標準溶液的質量濃度分別為0、5.00、10.00、20.00和40.00 μg·L-1.以上標準溶液均置于4 ℃冰箱內避光保存.

2.4 方法學考察

2.4.1 線性考察

將儀器參數調至最佳工作狀態(tài)，分別對0、5、10、20、40 μg·L-1硒標準溶液進行測量，每個濃度3次重復，記錄熒光強度測量值，取算術平均值后，按線性回歸法求出工作曲線的線性相關系數R2.

2.4.2 檢出限

將儀器參數調至最佳工作狀態(tài)，用硼氫化鈉作為還原劑分別對0、5、10、20、40 μg·L-1硒標準溶液進行3次重復測量，記錄熒光強度測量值，取算術平均值后，按線性回歸法求出斜率k.將“2.3”項下制備的0 μg·L-1的硒標準溶液連續(xù)進行11次硒含量測量，記錄其熒光強度，求出其相對標準偏差S0，按下式計算出檢出限Q.按照2009版《中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程》，Q≤0.4 ng·mL-1.

Q=3S0/k.

(1)

2.4.3 加樣回收實驗

分別精密稱取9份0.5 g黨參樣品，按“2.1.2”項下操作進行消化，同時制備空白對照，后向樣品消化液中加入適量硒標準溶液，配制成含硒加入濃度分別為低、中、高3個質量濃度的對照品溶液(分別相當于原待測樣品中質量分數的80%、100%、120%).每個濃度平行配制3份，記錄硒熒光強度值(A)，計算硒熒光強度值(ΔA=A-A0)，根據下列公式計算回收率.

回收率(%)=(測定總量-硒含量)/加入量*100 .

(2)

2.4.4 精密度試驗和準確度試驗

精密度試驗中取10 μg·L-1標準溶液1 d內連續(xù)進樣7次，在擬定的條件下進行硒含量測定，記錄硒濃度值，計算其相對標準偏差(RSD)值.準確度試驗中對同一份黨參樣品進行硒含量測定6次.計算其硒含量平均值，計算相對標準偏差(RSD)值.

RSD(%)=標準偏差(SD)/平均值*100 .

(3)

(4)

2.4.5 穩(wěn)定性試驗

配制黨參樣品和空白組織樣品置于錐形瓶中，后按“2.1.2”項下操作處理進行原子熒光分析，分別在0、20、40、60、80、100 min按上述儀器條件進行含量測定，記錄熒光強度值.

2.5 數據處理

數據結果采用SPSS進行單因素方差(One-way ANOVA)及LSD和Dunnett檢驗進行多重比較分析(P<0.05)，所得統計結果使用Graphpad prism進行圖形繪制.

3 結果與討論

3.1 方法學考察

3.1.1 線性關系考察與檢出限

線性考察結果如圖1所示.

濃度/(μg·L-1)圖1 硒標準曲線

硒含量在0～40 μg·L-1質量范圍內與其熒光強度線性關系良好，回歸方程為y=57.371x+18.201(R2=0.999 9).檢出限為Q=0.065 ng·mL-1，符合JJJ 939—2009《中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程》要求(≤0.4 ng·mL-1).

3.1.2 加樣回收實驗

對照品溶液的加樣回收率平均值為113.33%，相對標準偏差(RSD)為4.97%，說明方法具有較好的精密度.符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》附錄F檢測方法確認的技術要求(60%～120%).結果見表1.

表1 加樣回收實驗結果

3.1.3 精密度試驗和準確度試驗

選用10.0 μg·L-1系標準溶液進行精密度測量，精密度RSD為1.65%.使用標準樣品進行準確度試驗6次，準確度RSD為4.58%.符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》附錄F檢測方法確認的技術要求(-20%～10%)，結果見表2.

表2 精密度試驗和準確度結果

3.1.4 穩(wěn)定性試驗

常溫下黨參樣品在0～100 min的穩(wěn)定性RSD為6.52%，結果見表3.

表3 穩(wěn)定性試驗結果

3.2 不同品種黨參的硒含量比較

采用同一地區(qū)的11個不同品種黨參探究對硒含量的影響，結果顯示不同品種之間的硒含量稍有不同但都在0.1 mg·kg-1以下(見圖2).

黨參品種圖2 不同品種黨參硒含量

4 結 論

建立一種簡便、快速、準確度、精密度好，線性范圍廣，所用試劑毒性較小，靈敏度高，重復性高，實用性強的原子熒光光譜法，方法檢出限低為0.065 ng·mL-1，標準曲線線性良好.硒含量在0～40 μg·L-1質量范圍內與其熒光強度呈現良好的線性關系(R=0.999 9)；檢出限為Q=0.065 ng·mL-1；加樣回收率為113.33%，RSD為4.97%；精密度RSD為1.65%；準確度RSD為4.58%；穩(wěn)定性RSD為6.52%；11個不同品種黨參之間的硒含量稍有不同但都在0.1 mg·kg-1以下.適用于測定黨參中的硒含量，為富硒黨參的質量評價提供方法基礎.