尹 佳,王玉瑤,謝富忠,劉得鵬,李繼鋒

(吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,吉林 吉林 132022)

在葡萄廢棄物中，葡萄籽的生物活性物質(zhì)最豐富.葡萄籽提取物(grape seed extract,GSE)是一種天然的保健食品，含有豐富的多酚，例如兒茶素、表兒茶素、原花青素和單體黃烷醇[1].實驗研究表明GSE具有很好的抑菌活性和抗氧化性能[2-3].柑橘是我國第一大水果，果實營養(yǎng)豐富，口感優(yōu)良,截止到2019年國內(nèi)柑橘產(chǎn)量已突破4 000萬噸.柑橘采摘后，失重較為明顯，導(dǎo)致其新鮮度大幅度下降，又因微生物感染等外在因素，在鮮銷過程中極易發(fā)生病害，每年鮮果損失率達(dá)25%～30%.本文就不同工藝制備的GSE的抗氧化活性進(jìn)行比較，使用抗氧化活性強(qiáng)的GSE對柑橘保險應(yīng)用效果等進(jìn)行研究，旨在開發(fā)植物源的天然保鮮劑，開拓保鮮技術(shù)領(lǐng)域，充分利用食品工業(yè)殘渣，減少環(huán)境污染，提高柑橘品質(zhì).

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

供試水果：市售柑橘(皇帝貢柑，產(chǎn)地廣東省四會市)，選擇大小均勻一致，無機(jī)械損傷和病蟲害的果實進(jìn)行處理；葡萄籽(品種赤珠霞)提取物：實驗室自制；聚乙烯塑料薄膜袋(義烏市智峰塑料制品有限公司，規(guī)格8×12 cm,厚度7絲).

JA-503分析電子天平：天津精拓儀器設(shè)備有限公司；DDL-5M離心機(jī)：濟(jì)南博鑫生物技術(shù)有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒儀器設(shè)備有限公司；PSH-25型酸度計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PR-5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：南通普瑞科技儀器有限公司；UV-1800紫外分光光度計：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；FD-2A真空冷凍干燥機(jī)：上海繼普儀器制造有限公司；GY-4型果實硬度計：山東食安生物科技有限公司；1260 Infinity II高效液相色譜系統(tǒng)：美國安捷倫公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 GSE的制備方法[4]

1.2.2 不同方法制備的GSE抗氧化活性的測定

(1) GSE清除DPPH·自由基清除能力測定[5-6]

配制濃度為0.1 mol·L-1的DPPH·乙醇溶液與不同濃度梯度的GSE溶液；分別量取2 mL的GSE溶液與2 mL的DPPH·乙醇溶液，混合均勻，之后在避光處靜置30 min；在517 nm波長條件下，測量混合溶液的吸光值，并計算DPPH·自由基清除率.加樣溶液與測定項目見表1.每組樣品溶液平行測定3次，取平均值.

表1 DPPH·自由基清除實驗加樣表

DPPH·自由基清除率(Y)按公式計算：Y=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：A0為未加入樣品溶液時所測溶液的吸光度；Ai為加入樣品溶液后所測溶液的吸光度；Aj為未加DPPH·溶液的樣品溶液的吸光度.

(2) GSE對鐵離子還原能力的測定[7]

取不同濃度GSE，加入濃度0.2 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 6.6)3.5 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合均勻，在50 ℃水浴中反應(yīng)25 min.再分別加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，搖勻，4 000 r/min離心10 min，然后取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL、0.1%的三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻,靜置10 min，在波長700 nm條件下測定其吸光度值.

1.2.3 GSE主要成分分析

參照李偉楠[8]的研究方法通過液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù),測定GSE中主要成分的含量.

1.2.4 GSE對柑橘防腐保鮮作用的研究

將GSE用蒸餾水稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.01%、0.1%和1%，將果實(剔除殘次果)分別置于不同濃度提取液中浸泡3 min，清水對照，待自然風(fēng)干后，用聚乙烯塑料薄膜袋單果包裝，選用普通庫房(室溫15～20 ℃，相對濕度65%～80%)貯存.常溫貯存期間每隔5 d測定1次樣品的失重率、可滴定酸含量、腐爛率、Vc含量、感官評價指標(biāo)、丙二醛含量和硬度等數(shù)據(jù)，評價GSE對柑橘保鮮的效果.

(1)失重率測定[9]：每隔5 d從各組中挑選15個稱重，結(jié)果取其平均值.

失重率計算公式為：W=(M1-M2)/M1×100%,

式中：W為柑橘樣品失重率，%；M1為柑橘樣品初始的重量，g；M2為測試當(dāng)天柑橘樣品的重量，g.

(2)硬度測定：使用GY-4型果實硬度計3.5 mm探頭進(jìn)行穿刺測量，1個樣品取3個位點測定硬度，并取其平均值[10].

(3)感官評價指標(biāo)：由通過專業(yè)感官評價培訓(xùn)的20名學(xué)生組成感官評定小組，以色澤、褶皺、風(fēng)味和腐爛情況為指標(biāo)，分別對果實的品質(zhì)進(jìn)行評定，評定標(biāo)準(zhǔn)見表2.

表2 感官評定標(biāo)準(zhǔn)

(4)腐爛率：每5 d觀察1次果實，當(dāng)柑橘表面出現(xiàn)水漬狀淡褐色病斑且伴有白色菌絲體則記為腐爛果實，記錄其數(shù)量[11].

腐爛率%=(腐爛個數(shù)/測定總數(shù))×100

(5)可滴定酸含量：采用NaOH滴定法測定[12].

(6)Vc含量：使用紫外分光光度法測定[13].

Vc含量=(C×V總×V待測總×100)/(V1×W總×1000)

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到的VC濃度，μg·mL-1；V1為測吸光度時吸取樣品溶液的體積，mL；V總為吸取果實定容總體積，mL；V待測總為待測樣品總體積，mL；W總為柑橘質(zhì)量，g； 100為100 g柑橘果實.

(7)丙二醛含量：采用硫代巴比妥酸法[14].稱取果實1.0 g，加入5.0 mL 100 g·L-1三氯乙酸溶液，研磨勻漿后，于4 ℃、8 000 r·min-1離心20 min.吸取2.0 mL上清液，加入2.0 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，混合后沸水浴20 min，冷卻離心，分別測定上清液在450、532、600 nm波長處的吸光度，重復(fù)3次取平均值.

(8)可溶性固形物(SSC)含量：取混勻后的果肉，榨取果汁，雙層紗布過濾，折光儀測定榨出果汁中的SSC含量，重復(fù)3次，取平均值.

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016對試驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和繪圖，用SPSS 13.0進(jìn)行方差分析,通過Duncan法多重比較判斷數(shù)據(jù)差異顯著性，P>0.05表示差異顯著.所有試驗重復(fù)3次.

2 結(jié)果與討論

2.1 GSE的抗氧化活性

將3種方法制備的GSE樣品稀釋為不同的質(zhì)量濃度，進(jìn)行清除DPPH·自由基能力和對鐵離子還原能力的測定，結(jié)果如圖1和圖2所示.GSE的DPPH·自由基清除率在實驗濃度范圍內(nèi)均呈增長的趨勢，并且超聲輔助回流法的DPPH·自由基清除率相對于單一的回流法與超聲法均有顯著的提高(P<0.05).分析原因主要是超聲波產(chǎn)生的機(jī)械力對葡萄籽細(xì)胞有破壁作用，使葡萄籽的有效成分在加壓條件和回流作用下更易分離析出，從而增加GSE的提取率，最終提高了GSE的抗氧化活性.GSE對鐵離子還原能力均隨質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢,尤其濃度為0.8 mg·mL-1時還原能力最高.采用超聲輔助回流法制備的GSE還原能力最大，即抗氧化活性更強(qiáng)[15]，所以GSE具有良好的體外抗氧化活性.

樣品濃度/(mg·mL-1)圖1 GSE對DPPH·自由基的清除能力

樣品濃度/(mg·mL-1)圖2 GSE對鐵離子的還原能力

2.2 GSE主要成分分析

GSE主要成分包括低聚原花青素、原花青素B2、兒茶素、表兒茶素等多酚類化合物,主要成分的含量見表3.

表3 GSE的主要成分

2.3 GSE對柑橘防腐保鮮作用的結(jié)果

2.3.1 柑橘果實失重率與硬度

如圖3所示，在常溫貯藏過程中，柑橘果實失重率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，這是由于果實長時間暴露在空氣中，仍然進(jìn)行呼吸和代謝作用,不斷消耗自身水分導(dǎo)致果實重量下降.與對照組相比，GSE處理組果實的失重率始終保持相對較低的水平；貯藏第40 d，1%濃度的GSE處理組果實失重率比對照組低27.26%，這兩組果實失重率之間差異顯著(P<0.05).GSE處理降低了貯藏期柑橘果實的失重率.

貯藏時間/d圖3 GSE對貯存期間柑橘失重率的影響

一般而言，硬度能夠直接反映出果實的成熟度和腐爛程度.

貯藏時間/d圖4 GSE對貯存期間柑橘硬度的影響

如圖4所示，在常溫貯藏過程中，柑橘果實硬度逐漸下降；1% GSE處理組明顯延緩了果實貯藏期間硬度的下降；貯藏第40 d，對照組果實的硬度下降到1.20 kg·cm-2，而0.01% GSE處理組的硬度比對照組高出13.33%，這兩組果實硬度之間差異不顯著(P>0.05).

2.3.2 果實感官評價與腐爛率

如圖5所示，在常溫貯藏過程中，柑橘果實感官評價呈現(xiàn)下降的趨勢.貯藏第10 d開始，對照組樣品品質(zhì)開始顯著下降(P<0.05)，樣品表面已經(jīng)出現(xiàn)明顯收縮，色澤暗淡，而經(jīng)GSE處理的果實的感官評價指標(biāo)始終保持相對較高的水平；貯藏第40 d時，1% GSE處理組的感官評價指標(biāo)比對照組高出46.38%(P<0.05).GSE處理延緩了貯藏期柑橘果實感官品質(zhì)的下降.

貯藏時間/d圖5 GSE對貯存期間柑橘感官評價指標(biāo)的影響

如圖6所示，GSE處理組均有效地抑制了柑橘果實的腐爛率.貯藏第40 d時，對照組腐爛率達(dá)到69.20%，而1%GSE處理組的果實腐爛率比對照組低47.25%(P<0.05).所以，GSE處理降低了常溫貯藏期柑橘果實的腐爛率.

貯藏時間/d圖6 GSE對貯存期間柑橘腐爛率的影響

2.3.3 果實可滴定酸含量與VC含量

果蔬中含有多種有機(jī)酸是植物品質(zhì)的重要檢測指標(biāo)，尤其是以果實為目的產(chǎn)品的植物，可溶性酸的含量是影響果實風(fēng)味品質(zhì)的重要因素[16].如圖7所示，在常溫貯藏過程中，柑橘果實可滴定酸(TA)含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢.在實驗前期和后期，與對照組相比，GSE處理組的果實TA含量始終保持相對較高的水平；貯藏第40 d時，0.1%GSE處理組比對照組高出28.95%，這兩組果實TA含量之間差異顯著(P<0.05).GSE處理減緩果實在貯藏期間風(fēng)味品質(zhì)的變化.

貯藏時間/d圖7 GSE對貯存期間柑橘可滴定酸含量的影響

Vc是一種具有還原性的物質(zhì)，在果蔬貯存過程中對其起保護(hù)作用.Vc可以清除果蔬體內(nèi)的自由基，降低自由基對果蔬機(jī)體的傷害[17].通常果蔬在采后常溫貯存時，Vc作為呼吸底物消耗導(dǎo)致含量下降，從而影響果蔬的品質(zhì).如圖8所示，在常溫貯存期各處理組Vc的含量均呈現(xiàn)下降的趨勢.貯藏第40 d時，對照組的Vc含量下降到8.38 mg·100 g-1，0.1%GSE處理組比對照組高出56.56%(P<0.05).GSE處理降低果實在貯藏期間Vc的損失.

貯藏時間/d圖8 GSE對貯存期間柑橘Vc含量的影響

2.3.4 果實的丙二醛含量與SSC含量的變化

植物衰老或是在外環(huán)境下受傷害，其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生丙二醛(MDA).所以通過測定MDA的含量可以掌握膜脂過氧化的程度，間接反映細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損程度和植物衰老程度[18].如圖9所示，樣品的丙二醛含量在常溫貯存期呈現(xiàn)上升的趨勢，貯藏第40 d時，0.1% GSE處理組果實中丙二醛含量為0.087 3 moL·g-1·Fw)，比對照組低出22.26%(P<0.05).GSE處理對柑橘具有延緩后熟衰老作用.

貯藏時間/d圖9 GSE對貯存期間柑橘丙二醛含量的影響

柑橘的可溶性固形物(SSC)含量越高，說明柑橘成熟度越高；反之，柑橘成熟度越低.如圖10所示，貯藏至第5 d時，對照組的SSC含量明顯升高，達(dá)17.4%；貯藏至第40 d時，對照組果實的SSC含量均達(dá)12.17%，而1% GSE組的SSC含量為10.31%，低于對照組15.28%.表明GSE處理能有效延緩SSC含量的上升速度，增強(qiáng)柑橘的耐貯藏性.

貯藏時間/d圖10 GSE對貯存期間柑橘SSC含量的影響

3 結(jié) 論

柑橘采后常溫貯存條件下應(yīng)用GSE處理進(jìn)行保鮮，不僅沒有對柑橘品質(zhì)產(chǎn)生不良影響，而且能在一定程度上降低柑橘腐爛率和失重率，延緩Vc含量和可溶性酸含量的下降，進(jìn)而延緩柑橘的后熟衰老,增強(qiáng)柑橘的耐貯藏性.因此GSE處理能改善柑橘的貯藏品質(zhì)，增強(qiáng)柑橘的保鮮性，延長貨架期.GSE對減少釀酒飲料加工副產(chǎn)物葡萄籽的浪費和降低環(huán)境污染具有重要的實踐意義，有望開發(fā)成為相對安全、環(huán)保、無公害的果實保鮮劑.