劉 暢 徐婉秋 許曉航 王秀梅

牙骨質(zhì)在1835 年被發(fā)現(xiàn)且描述[1]，是包繞牙根表面的一層骨樣物質(zhì)。作為牙體的重要組成部分，牙骨質(zhì)主要有兩項(xiàng)功能，一是把牙周組織和牙體組織結(jié)合在一起，二是可以修復(fù)牙根表面的損傷。牙骨質(zhì)的修復(fù)能力在臨床上具有重要意義，主要表現(xiàn)在它不但能修復(fù)由于過(guò)度咬合力等因素造成的根面小范圍骨吸收和牙骨質(zhì)折裂，還能在根管治療、根尖切除術(shù)后新生牙骨質(zhì)并覆蓋根尖孔，重新建立牙體與牙周組織的聯(lián)系。另外，正畸牙移動(dòng)時(shí)有約20%的牙齒會(huì)出現(xiàn)牙根吸收[2]，表現(xiàn)為根面凹陷，牙根變短，牙齒的松動(dòng)甚至脫落，此時(shí)牙骨質(zhì)的修復(fù)就顯得尤為重要。成牙骨質(zhì)細(xì)胞(cementoblasts，CB)附著在牙根表面可形成前期牙骨質(zhì)，進(jìn)而礦化為成熟牙骨質(zhì)，在牙根修復(fù)中起到重要作用[3]。2000 年，D’Errico 等成功培養(yǎng)出了永生化的成牙骨質(zhì)細(xì)胞OCCM-30[4]，現(xiàn)已作為成熟的成牙骨質(zhì)細(xì)胞系開展相關(guān)研究。

二甲雙胍(metformin，MF) 作為降糖藥物對(duì)于糖尿病的作用已經(jīng)得到肯定，Cortizo 首次研究了MF 在成骨細(xì)胞系分化中的作用，顯示一定濃度的MF 在24 小時(shí)內(nèi)呈劑量依賴性促進(jìn)UMR106和MC3T3 細(xì)胞的增殖、分化和礦化[5]。隨著大量研究的深入，其在成骨方面的作用得到了廣泛的關(guān)注和證實(shí)[6]。CB 和成骨細(xì)胞具有很高相似性，但目前關(guān)于MF 作用于成牙骨質(zhì)細(xì)胞的研究尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)用一定濃度的MF 作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OCCM-30 細(xì)胞，檢測(cè)MF 對(duì)OCCM-30細(xì)胞增殖、分化和礦化能力的影響，為臨床牙骨質(zhì)修復(fù)再生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 OCCM-30(原吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院孫宏晨教授團(tuán)隊(duì)友情贈(zèng)予)，二甲雙胍(索來(lái)寶公司)、F12 培養(yǎng)基(Gibco 公司，美國(guó))、雙抗(碧云天生物技術(shù)有限公司)、MTS(sigma 公司，美國(guó))、ALP 檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)、茜素紅(sigma 公司，美國(guó))、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒(Roche 公司，瑞士)、BSP 和Runx2抗體(武漢三鷹生物有限公司)、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)、細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱(Thermo Scientific 公司，美國(guó))、倒置顯微鏡(Nikon 公司，日本)、LightCycler ?480 熒光定量PCR 儀(Roche 公司，瑞士)、垂直板電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad 公司，美國(guó))、電泳儀(Amersham Biosciences 公司，美國(guó))、GraphPad Prism 5.0 軟件、Imaga J 軟件、Image Pro Plus 6.0 軟件。

1.2 方法

1.2.1 成牙骨質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)OCCM-30 細(xì)胞[7]，在細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%時(shí)于無(wú)菌超凈臺(tái)上傳代，用PBS清洗細(xì)胞兩次，適量預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞，顯微鏡鏡下見細(xì)胞變圓脫壁時(shí)用含血清培養(yǎng)基終止消化。900r/ min 離心5min，棄上層液體，取新鮮培養(yǎng)基吹散細(xì)胞制成均勻細(xì)胞懸液，1∶2 傳代，隔天換液。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力的測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成均勻的細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為50000 個(gè)/ ml，種于96 孔板，每孔100ul 細(xì)胞懸液。待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組，換用含有不同MF 藥物濃度(0、25、50、100、200、400、800、1600μmol/ L)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。放入培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 小時(shí)后，每孔加入20μl MTS，放入培養(yǎng)箱中孵育4 小時(shí)，酶標(biāo)儀在490nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值并記錄。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)檢測(cè)細(xì)胞中Runx2(runt-related transcription factor 2，Runx2)和BSP (bone sialoprotein，BSP)mRNA 的表達(dá)水平

將OCCM-30 細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種到六孔板，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組，實(shí)驗(yàn)組分別用含MF濃度為200、400μmol/ L 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)照組不加藥。在分組后的12、24、48 小時(shí)分別提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用Real-time PCR 試劑盒進(jìn)行PCR 反應(yīng)。目的基因?yàn)镽unx2 和BSP，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，其引物序列[7]參照表1。利用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 目的基因和β-actin 基因的引物序列

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中Runx2 和BSP 蛋白的表達(dá)水平 將貼壁的OCCM-30 細(xì)胞分為用含200μmol/ L MF 培養(yǎng)基培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組，和不含MF 的對(duì)照組。分組培養(yǎng)12、24、48 小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞1 小時(shí)。4℃，14000r/ min 離心40 分鐘,取上清液采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。加入適量蛋白上樣緩沖液，100℃，8 分鐘，煮沸變性。配置SDS-PAGE 凝膠，上樣，進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜。將PVDF 膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 小時(shí)，TBS 洗膜。I 抗4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST 洗膜，室溫下避光孵育II 抗1 小時(shí)，洗膜后將膜置于曝光機(jī)內(nèi)顯影。采用Imaga J 軟件對(duì)各條帶進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH 為內(nèi)參，以條帶灰度值比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性測(cè)定取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的OCCM-30 細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種到六孔板，貼壁后分為對(duì)照組和200μmol/ L 的MF 實(shí)驗(yàn)組。分別在第3、7天收集細(xì)胞沉淀于EP 管中，每管加入1ml Triton X-100 裂解液，40 分鐘后，按ALP 試劑盒進(jìn)行操作，同時(shí)用BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。細(xì)胞中ALP 活性(金氏單位/ gprot)=(測(cè)定OD 值－空白OD 值)÷(標(biāo)準(zhǔn)OD 值－空白OD 值)×酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.02mg/ ml)÷待測(cè)樣本蛋白濃度(gprot/ ml)。

1.2.6 茜素紅染色法檢測(cè)細(xì)胞外礦化結(jié)節(jié)形成細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于六孔板，待貼壁后分別加入含0、200μmol/ L MF 的礦化誘導(dǎo)液，隔天換液。培養(yǎng)21 天后，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 分鐘，1%茜素紅染液染色，鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0 軟件分析礦化結(jié)節(jié)面積百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間兩兩比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 MF 對(duì)OCCM-30 細(xì)胞增殖能力的影響MTS 法測(cè)定MF 對(duì)OCCM-30 細(xì)胞增殖作用的影響，結(jié)果如圖1 所示，200μmol/ L MF 組在24、48、72 小時(shí)均對(duì)OCCM-30 細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，且在48、72 小時(shí)作用明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05，**P＜0.01)。400μmol/ L MF組在48、72 小時(shí)亦對(duì)OCCM-30 細(xì)胞存在促進(jìn)作用(*P ＜0.05)。在MF 作用細(xì)胞72 小時(shí)時(shí)，1600μmol/ L MF 對(duì)OCCM-30 細(xì)胞的增殖有抑制作用(*P＜0.05)。說(shuō)明MF 對(duì)OCCM-30 細(xì)胞的促增殖作用可能依賴于劑量和時(shí)間，高濃度MF作用細(xì)胞一定時(shí)間后會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抑制作用。其中200μmol/ L MF 對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)效應(yīng)最明顯，我們推測(cè)體外培養(yǎng)OCCM-30 細(xì)胞的最佳MF 濃度為200μmol/ L，因此后續(xù)多選用對(duì)細(xì)胞活力最有益的200μmol/ L MF 進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度MF 對(duì)CB 增殖能力的影響

2.2 MF 對(duì)OCCM-30 細(xì)胞中Runx2 和BSP mRNA 表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組相比，12、24、48 小時(shí)時(shí)200μmol/ L、400μmol/ L 的MF 組BSP和Runx2 mRNA 的表達(dá)水平均明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P＜0.05，**P＜0.01)。其中Runx2 mRNA 在200μmol/ L MF 作用下升高更明顯，而BSP mRNA 則在400μmol/ L MF 作用下升高更明顯(見圖2)。

圖2 MF 對(duì)Runx2 和BSP mRNA 表達(dá)水平的影響

2.3 MF 對(duì)OCCM-30 細(xì)胞中Runx2 和BSP蛋白表達(dá)的影響 WB 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，200μmol/ L MF 作用12、24、48 小時(shí)后，Runx2 和BSP 蛋白表達(dá)水平均有提高，且MF 對(duì)BSP 蛋白表達(dá)的影響更大。分析各目的條帶與GAPDH 灰度值的比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示：200μmol/ L MF 作用12、24 小時(shí)對(duì)BSP 蛋白的表達(dá)具有促進(jìn)作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05，**P＜0.01)，在24 小時(shí)對(duì)BSP 蛋白表達(dá)的影響最顯著(t=5.508，P=0.0053)；作用細(xì)胞24、48 小時(shí)對(duì)Runx2 蛋白表達(dá)增加的影響亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P＜0.05)(見圖3)。

圖3 MF 對(duì)Runx2 和BSP 蛋白表達(dá)水平的影響

2.4 MF 對(duì)OCCM-30 細(xì)胞中ALP 活性的影響 用200μmol/ L MF 處理OCCM-30 細(xì)胞3 天，結(jié)果顯示ALP 的活性高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.456，P=0.0112)。7 天200μmol/ L MF 組的ALP 活性較對(duì)照組略有升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。提示MF 可以在早期誘導(dǎo)OCCM-30 細(xì)胞的成骨分化。

圖4 MF 對(duì)ALP 活性的影響

2.5 MF 對(duì)OCCM-30 細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響 含200μmol/ L MF 的礦化誘導(dǎo)液和不含MF的礦化誘導(dǎo)液分別作用OCCM-30 細(xì)胞21 天后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均可見礦化結(jié)節(jié)。采用茜素紅染液染色后，鏡下可明顯見到紅色礦化結(jié)節(jié)和鈣鹽沉積。與對(duì)照組相比，MF 組礦化結(jié)節(jié)體積較大，鈣鹽沉積更明顯(見圖5)。Image Pro Plus 6.0 軟件分析礦化結(jié)節(jié)面積百分比，顯示200μmol/ L MF 組細(xì)胞外礦化結(jié)節(jié)面積百分比更大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.748，P=0.0090)(見圖6)。

圖5 MF 作用于OCCM-30 細(xì)胞21 天后的茜素紅染色結(jié)果

圖6 MF 誘導(dǎo)OCCM-30 細(xì)胞21 天后各組細(xì)胞外礦化結(jié)節(jié)面積百分比

3.討論

牙骨質(zhì)在解剖學(xué)和功能上分別歸于牙體組織和牙周組織，是將牙體與牙周組織聯(lián)系在一起的重要結(jié)構(gòu)。在生理情況下，牙骨質(zhì)一直在不斷的新生而較少有吸收；而在病理情況下，如年輕恒牙牙髓炎[8]、侵襲性牙周炎的患兒常伴有牙骨質(zhì)發(fā)育異常導(dǎo)致的牙根縮窄、彎曲等現(xiàn)象[9]。成牙骨質(zhì)細(xì)胞作為參與牙根發(fā)育的重要功能細(xì)胞，分泌形成牙骨質(zhì)，在牙根的吸收和修復(fù)過(guò)程中起到重要的作用。目前，眾多研究者將材料學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)相結(jié)合，如ε-氨基己酸/ 殼聚糖顆粒[10]和氧化鋅納米顆粒[7]等材料的引入為提高成牙骨質(zhì)的礦化能力，促進(jìn)牙骨質(zhì)再生提供了新方法。MF 是臨床上的一線降糖藥物，其治療糖尿病的效果已經(jīng)得到充分肯定。近年來(lái)，其在骨損傷修復(fù)方面的作用和機(jī)制也得到了廣泛的關(guān)注和證實(shí)。有研究顯示，MF 可通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶而增加細(xì)胞AMP/ ATP 的比值，導(dǎo)致胰島素和溶酶體的急劇活化，使細(xì)胞內(nèi)葡萄糖水平降低，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[6]。MF 通過(guò)調(diào)控sirt6 和oct4 的表達(dá)可以促進(jìn)小鼠前成骨細(xì)胞的增殖和分化[11]。在高血糖條件下，MF可促進(jìn)牙種植體周圍骨的形成，提高種植體早期骨結(jié)合率[12]。此外，MF 還可通過(guò)BMP-4/ Smad/Runx2 信號(hào)通路提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化潛能，促進(jìn)骨形成[13]。

目前，關(guān)于MF 作用于CB 的研究尚未見報(bào)道，MF 能否促進(jìn)相關(guān)口腔疾病導(dǎo)致的牙骨質(zhì)吸收破壞的修復(fù)尚不清楚。本研究在細(xì)胞水平和分子水平上對(duì)不同濃度的二甲雙胍對(duì)CB 增殖、分化及礦化的能力的影響進(jìn)行初步探究。體外細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，適宜濃度的MF 對(duì)OCCM-30 細(xì)胞具有一定的促增殖效應(yīng)，其主要依賴于劑量和時(shí)間。200μmol/ L 和400μmol/ L 二甲雙胍在處理細(xì)胞1～3 天時(shí)均對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，這與以往用二甲雙胍處理成骨細(xì)胞系的研究結(jié)果相似。本研究中高濃度1600μmol/ L MF 作用3 天時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，前兩天則抑制作用不明顯，分析原因可能為高濃度二甲雙胍會(huì)對(duì)OCCM-30 細(xì)胞周期逐漸產(chǎn)生抑制作用，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。

Runx2 是成骨細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細(xì)胞分化和骨形成方面起到重要的作用[14]。ALP是成骨細(xì)胞早期分化的指標(biāo)，與骨組織重建和骨基質(zhì)礦化關(guān)系密切[15]。ALP 的表達(dá)代表著骨形成的情況，表明細(xì)胞分化的開始，其活性的高低能反應(yīng)成骨細(xì)胞分化成熟的程度[16]。本實(shí)驗(yàn)提示一定濃度的MF 可促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞早期礦化。由于本實(shí)驗(yàn)采用F12 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，故推斷MF 促進(jìn)礦化的作用可不依賴于礦化誘導(dǎo)液。礦化結(jié)節(jié)的形成是成骨細(xì)胞分化的最后階段，本實(shí)驗(yàn)采用茜素紅染色法評(píng)價(jià)最終的骨形成情況。200μmol/ L MF培養(yǎng)OCCM-30 細(xì)胞21 天后，鏡下顯示MF 組與對(duì)照組均有明顯的礦化結(jié)節(jié)形成，而MF 組的礦化結(jié)節(jié)更大，鈣鹽沉積也更加廣泛。說(shuō)明MF 對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞外的基質(zhì)形成和礦化具有促進(jìn)作用。

BSP 在牙骨質(zhì)的發(fā)育初期高表達(dá)，具有誘導(dǎo)成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化和粘附的功能[17]。研究表明，在牙骨質(zhì)的礦化過(guò)程中，BSP 參與了礦化中心的形成并可誘導(dǎo)牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的礦化[18]。有學(xué)者在成牙骨質(zhì)細(xì)胞形成細(xì)胞結(jié)節(jié)后持續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞結(jié)節(jié)形成礦化結(jié)節(jié)的過(guò)程中，BSP 持續(xù)高表達(dá)[19]。本研究結(jié)果顯示，用200μmol/ L MF 處理OCCM-30一定時(shí)間可在基因和蛋白層面促進(jìn)Runx2 和BSP的表達(dá)。

本研究結(jié)果使MF 可以促進(jìn)骨形成的作用得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，本實(shí)驗(yàn)首次提出一定濃度范圍內(nèi)的MF 能促進(jìn)CB 的增殖、分化及礦化，提高CB 的成骨能力，為進(jìn)一步探究MF 促進(jìn)牙骨質(zhì)再生的作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，為各種原因?qū)е碌难栏?、牙骨質(zhì)破壞的修復(fù)提供新的用藥思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。